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流式细胞术是一项可以快速检测大量单细胞多参数的技术，在免疫学中需要越来越多的参数来区分不同免疫细胞群体并研究其生物学性质，然而，受到仪器光路设计的限制，每台仪器可用的荧光通道数量是有限的。因此，很多FLOWER要么就那几个通道分析较少的细胞群体，要么分开多管染色，每管之间有多个重复的系列标记，这两种方法均有问题，前者会使得获取的信息量明显减少，后者会存在管与管之间的误差，并且患者样本有限时比较麻烦。 美国的Francesco Boin等人在2017年12月份的Plos ONE上给我们带来了2色7个系列特异性抗体的染色方案，可以用尽可能少的通道确定出常见的免疫细胞群体——CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，γδT细胞，B细胞，NK细胞和经典单核细胞，剩下的其它通道就可以留给需要的检测标记了。 方案由CD3、CD56、TCRγδ、CD4、CD8、CD14、CD19七个抗体组成。至于荧光素，文章提供了多个方案，但无论哪个方案，均需进行抗体滴定，使得CD3和CD8上阳性群和阴性群能够隔开2个数量级，而CD4则反而要减少阳性群和阴性群之间的分隔，避免其干扰CD8弱表达的T细胞和γδT，详细过程后面分析再述。 方案1、PBMC样本采用的2色7抗体方案，附用量说明（BV421和PE搭配）
方案2、PBMC样本采用的2色7抗体方案，附用量说明（APC和PE搭配）
方案3：全血样本采用的2色7抗体方案，附用量说明（BV421和PE搭配）
方案优化步骤 首先当然是排除粘连体和死细胞：
接着，先加CD3 APC，使其阳性和阴性群距离在2个数量级左右：
再加CD8 PE，使其CD8高表达T细胞和CD8－细胞群距离在2个数量级：
再加CD4 PE，使CD4＋T细胞的位置在CD8阳性群和阴性群的中间位置，如此可避免对CD8弱表达的T细胞以及后面TCRγδ检测的干扰：
继续加CD56 APC，使得CD56＋的NK位置在CD3阳性群和阴性群中间：
再加CD19 PE，CD19抗体还算好，位置问题不大，只要与阴性群分开即可：
再加TCR γδ APC，此类细胞应出现在APC最高的位置：
最后加CD14 PE，单核细胞的门与淋巴细胞门是分开的，不会受到淋巴细胞标记的影响：
方案效果如何？ 为了验证这个2色7抗体方案的准确性，作者将其与7色7色抗体方案进行了比较，经典的7色方案如下：
对比结果如下，可见结果无差异：
实战应用 检测多发性骨髓瘤患者干细胞移植后第0天的PBMC。方案如下：
首先依然是常规的排除粘连体和死细胞，接着展示2色散点图：
在2色散点图上，由于有研究认为，一些骨髓瘤患者的B细胞会同时表达CD56，所以设门方案略做调整，先同时圈中NK细胞和B细胞区域，接着用HLA-DR和CCR6散点图，分别圈出B细胞和NK细胞。
通过CD45RA和CCR7，分别分析CD8＋T和CD4＋T的初始、中央记忆、效应记忆、效应记忆RA＋四个亚群，并分析各初始和记忆亚群的HLA-DR和CD57表达。
最后，在CD4＋T细胞中，分析Th1、Th2、Th9，以及分析NK细胞中CD57和CD16表达。
有时候，发挥聪明才智，充分利用现有条件，做到更多颜色，也不是不可能的事情，你说是吧？ |
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