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随着流式细胞仪的普及，流式细胞术的应用越来越广泛，特别是免疫学和干细胞生物学研究领域，流式细胞术必不可少，然而，大家对流式细胞术的掌握程度参差不齐，大部分科研工作者对流式的应用还局限于四色以内分析，对于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合适，导致各染料之间干扰很大，结果很难分析。本文总结了流式多色染色荧光搭配的六点技巧，希望对广大科研工作者有一定的参考作用。 一：选择流式细胞仪能检测的染料 当流式细胞染色确定好指标之后，需要给每个指标对应的抗体配上相应的荧光染料，我们需要选择流式细胞仪能检测的染料，这就要求我们了解流式细胞仪以下信息：1、仪器有几个激发器（激光管）；2、每个激发器对应有哪些检测通道。 下表列出了流式细胞仪的激发器和每个激发器对应能检测的染料： 上表仅列出了每个激发器可能激发的染料，并未列出所有染料，但不是仪器配置了该激发器就一定能激发出对应的染料，还需要根据仪器的通道配置来选择，即每个激发器对应有哪些检测通道，而每个检测通道只能对应检测一种染料，但不同染料可能是由同一个检测通道来检测，那么这些染料我们称之为荧光对等染料，荧光对等染料是不能共用的。 下表列出了每个通道的荧光对等染料： 二：弱表达抗原选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料 荧光染料亮度有强弱之分，抗原表达有高低区别，因此，对于一些低表达的抗原，我们在搭配对应抗体的染料时，应该选择荧光较亮的染料，而对于高表达的抗原，我们则可选择相对较暗的荧光染料。 因抗原表达密度受细胞类型以及细胞活化程度的影响，所以在此无法详细列出各抗原的表达密度强弱。但荧光染料的强弱是固定的，下表列出了常见荧光染料的强度对比图。 三：低表达抗原应该选择染料之间有较小干扰的染料（即将弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道），强表达抗原应该选择染料之间对其他染料干扰较小的染料（即将强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道） 低表达的抗原最终染色的信号较弱，容易受其他检测通道的干扰，因此为了减少其他通道的信号对其造成的干扰，我们应当选择干扰较小的检测通道，比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC这四色一起检测时，弱表达抗原应该搭配APC荧光染料标记的抗体；强表达的抗原最终染色的信号较强，容易对其他检测通道造成干扰，因此我们应该选择对其他通道干扰较小的荧光染料，举例如上。 四：表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道，共表达的抗原避免放在相互干扰的通道 表达相互排斥的抗原指的是两种抗原不会同时表达在一种细胞上，这两种抗原表达在两种细胞上（例如CD4和CD8），因此流式图上分群很明显，即使荧光染料之间干扰很大，也很容易通过补偿的调节避免干扰；而共表达的抗原指的是这两种抗原表达在同一种细胞上（例如CD4和CD25），在流式图上我们是要分析双阳性的细胞比例，因此如果这两个抗体对应的荧光染料之间有干扰，则会对圈门结果造成干扰，影响分析的细胞比例。 五：细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素 胞内抗原的检测需要打孔，让标记荧光素的抗体分子可以进入细胞内，因此有两点要求，第一打孔试剂对荧光素没有影响，这就要求我们尽量不要选择复合染料（固定剂会使复合染料解偶联），第二确保荧光素标记的抗体可以进入细胞内，这就要求荧光素标记的抗体分子量尽量小，所以我们优先选择小分子应该素，例如PE\ FITC\ APC。 六：上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰 下级抗原是在上级抗原的基础上分析的，例如我们圈门CD45(上级抗原)分析CD3(下级抗原)阳性的细胞，这要求我们上下级抗原之间尽可能减少荧光之间的干扰，否则会影响圈门分析的结果。 以上所述六点技巧是多色配色中需要注意的要点，当然涉及多色配色（6色以上）往往很难同时达到上述六点技巧，我们只能尽可能满足这些要求，减少因荧光染料搭配不当对实验结果的影响。
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