流式课堂 | 流式配色基本原则

流式细胞实验操作其实是非常简单的一个实验：

样本制成单细胞悬液+抗体加进去染色

实验就做完了

对于大多数新手来说

流式细胞实验前的指标选择和配色才是大家关注的重点

很多人通过文献知道自己要做什么指标

但不理解文献里面为什么要这样配色

是基于什么原因来做配色方案的？

                        

                                        本期，我们为大家带来“流式配色基本原则”

  

                                                 流式配色遵循以下基本规则：

强弱搭配

选择干扰少的荧光组合

使分析的复杂程度降到最低

谨慎使用串联染料

注意环境因素对荧光素的影响

我们要如何理解这段话呢？

“强弱搭配”，指的是目标Marker表达量和荧光素的强度要做到强弱搭配，如果出现强强搭配时，强荧光对弱荧光有干扰的话，那么弱弱组合就像大象身边的狗尾巴草，或者白天的萤火虫，会被完全忽视掉。

  

不同于WB、IHC、IF或者ELISA检测等单指标检测方法，流式细胞实验一般是多指标检测，仪器检测荧光素的时候，可能会被其他荧光素发出的光干扰。高中物理老师说过：“光具有波粒二象性”。

  

手机/相机拍照时，只需要“咔嚓”一下，就可以把五颜六色收集到一起；而流式细胞仪以光波的形式，分段接收、检测荧光。

我们可以回想一下：听收音机的时候，如果有电话打进来，收音机会受到电话信号的无线电干扰，发出“呲呲”的声音。同样地，流式细胞仪在检测某个颜色的光波时，可能会受到相邻颜色荧光信号的干扰，所以，在做流式配色时，我们要“选择干扰少的荧光组合”。

  

受制于流式细胞仪的配置，出现荧光干扰在所难免。如何将这种影响降到最低呢？

首先

实验需要设置单阳对照，用于调节补偿。在做数据分析时，为了将这种荧光干扰降到最低，可以考虑将有溢漏的荧光素，放在相互排斥的Marker上。

其次

如果是共表达的Marker，在表达量高的情况下，是允许溢漏的。

最后

配色时需要考虑Marker的亲子代关系，子代可以向亲代溢漏，亲代不可以向子代溢漏。这么做是为了“使分析的复杂程度降到最低”。

如果目标Marker较少，比如三色、四色等，应尽量选择单体染料（例如：FITC、PE、APC等）。如果检测Marker较多，或者流式细胞仪激光器受限，串联染料（PE/Cyanine5、PerCP/Cyanine5.5等）的使用，是非常有必要的。

大部分串联染料，在光照或者实验操作有“固定”步骤时，容易出现降解。所以，在实验过程中，要避免对串联染料进行固定，同时，要严格按照实验标准化流程操作，避免荧光素降解引起的实验问题。

除了刚才提到的光照和“固定”，容易对串联荧光素造成影响外，串联染料的长期孵育，也会对结果造成影响。因此，细胞染色后，请尽快安排上机检测，特别是在串联染料不便固定时。另外，FITC对低pH环境敏感，如果您的样本pH值较低，一定要注意避免使用FITC染料。