【罗工流式秘籍19】流式凋亡双染实验的技巧小结

Hi~ 好久不见，各位小主们新年好呀~~罗工在春节胖了5斤，简直不要太难过，只有化悲愤为力量，争取在新的一年里写出更多有用的秘籍，来帮助大家更加顺利的做好流式实验：）

这期文章我们也作为新的一年的开始，将流式应用最常做的凋亡双染实验做一个实验技巧小结，希望能够帮助到准备或正在做凋亡双染的各位亲们。

什么是凋亡双染实验呢？

所谓凋亡双染，就是同时对目的细胞进行AnnexinV和核酸染料（例如PI,7-AAD,DAPI）两种染料染色，从染色结果评估细胞凋亡水平的一种最主流的细胞凋亡检测实验：

通过AnnexinV是否染色来判断细胞膜是否反转从而确定细胞是否凋亡；

通过核酸染料是否染色来判断细胞膜是否破裂从而确定细胞是出于早期凋亡还是晚期凋亡/坏死；

一个合格的凋亡双染实验一般会出现经典的3分群，从而方便我们判断细胞的整体凋亡水平：

那么在凋亡双染实验中，我们有哪些细节是值得注意的呢？从整个实验的时间线流程来说，有5个节点关系到凋亡双染的实验好坏，分别是：

选择凋亡双染试剂盒——制备待测样本——设置对照样本——上机收集数据——后续数据分析圈门

一、选择凋亡双染试剂盒

在进行凋亡双染的实验之前，我们往往都要先去购买或者选择凋亡双染试剂盒，没错，虽然我们使用过的染料AnnexinV是固定的，但是AnnexinV偶联的荧光及核酸染料却是多种多样的，最常见的2种搭配为AnnexinV-FITC+PI，或者是AnnexinV-PE+7-aad。这两种试剂盒的适用场景和我们的样本本身是否携带自发荧光高度关联。

当我们的样本本身不携带任何荧光时，我们选择任意搭配都可以，例如Annexin-FITC+PI或是AnnexinV-PE+7-aad；

而当我们的样本中含有GFP时，其绿色的光会和FITC高度重叠，会覆盖掉AnnexinV-FITC染色的阳性结果呈现全阳性，此时就只能选择AnnexinV-PE+7-aad了；并且当GFP特别高时隔壁的PE也会被影响到，此时推荐自行配置AnnexinV-APC+7-aad进行检测：

相关试剂盒的产品信息整理如下：

二、样本制备的2个关键点：

1. 减少样本的假阳性：

由于任何细胞损伤都会导致AnnexinV呈现阳性，所以在凋亡样本的制备时，对细胞膜损伤要尽可能降低到最小，包括：尽可能充分而不过度的消化贴壁细胞；离心的转速不应高于300g，不使用涡旋仪高速涡旋混匀细胞等；

2. 避免染色出现假阴性：

由于AnneixnV这个探针需要有钙离子存在于细胞表面时才能着色，所以我们要避免一切洗脱细胞表面钙离子的因素，例如使用含EDTA的酶，或是检测血样时使用紫头采血管等。

三、设置对照样本：

凋亡双染我们一般要设置哪些对照样本呢？在我看来，至少推荐大家做如下3种对照：

1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。

2. 阴性对照：未诱导凋亡的样本，同时加入Annexin V/PI双染，此时细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。

3. 单阳样本：诱导凋亡的样本，分为2管，单独染色Annexin V和PI，用来调后续的补偿

Ps：对于制备单阳样本的凋亡诱导，我们可以选择一个非常快捷简单的方法，就是直接把制备好的样本拿到开水里烫一下，马上就会产生一管效果超群的单阳对照了。

四、上机收集数据：

1.上机时我们可以先使用空白管上机，此时调节好细胞群在FSC和SSC的位置，让细胞主体位于散点图的正中或稍微左下一点；

2.3.然后使用阴性对照管上机，此时调节AnnexinV和PI的电压，让阴性细胞群位于图像左下，而阳性细胞群不超过图像的右上边界；

最后收集AnnexinV和PI的单染，调节补偿后即可上样本管无脑收集数据了。

五、上机后数据分析和圈门策略：

首先，凋亡双染的圈门一般选择在gate主体细胞后进行十字门象限门进行分析：

其次，当凋亡细胞带有阴性偏阳性的非特异性着色，以及单独AnnexinV阳性可能分群不明显时，推荐大家通过细胞的双阳性位置进行界定，因为双阳的位置相对于双阴的位置在凋亡双染里更加稳定，此时这样圈门结果更准确：

如上就是我们在做凋亡双染时一些常见的问题和注意要点了，怎么样，看完后是不是觉得困惑少了很多呢？当然，也欢迎各位老师在留言板留下您的实验经验，我们也会抽取其中的3名赠送一份新年小礼物哦~ 

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