一个神奇的FFPE样本建库神器之RNA篇

生物_医药_科研 2018-12-25

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一个神奇的FFPE样本建库神器之RNA篇

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian

Formalin Fixed and Paraffin Embedded

FFPE最早主要是用于病理形态学的观察。随着NGS技术的快速发展，从FFPE样本中分离纯化核酸进行后续的研究逐渐成为重要手段。
但是，FFPE-RNA测序无疑是“难于上青天”的存在。首先，在FFPE样本处理和储存过程中，很容易发生核酸的降解和损伤，而且RNA相比DNA更易降解。再者，众所周知，完整的RNA分子含量非常有限，总RNA样本中约90%都是核糖体RNA（rRNA）序列，所以从有限且珍贵的材料中获得完整且准确的信息有很大的难度。

所以，
如果恰好做转录组的测序，如果恰好是FFPE来源样本，如果恰好有以上困惑，
那么，这个神器值得拥有

【SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian】

“离经叛道”的rRNA去除模式

FFPE样本珍贵，担心从总RNA中去除rRNA，会造成纯化后的起始样品太少？选择它吧，不按套路出牌的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian（以下简称SMARTer Pico v2），特别的黑科技Zap R v2& R-Probes核糖体cDNA去除技术，可以实现不需要前处理（去除核糖体RNA），带来不一样的操作体验！

技术概要：

(以上图片来源于Takara Bio Inc.)

“难以置信”的RNA品质包容度

FFPE样本降解严重，害怕不能得到高质量文库？选择它吧，专为低质量样本设计的，可以FFPE样本中提取的的total RNA起始，6小时内制备具有方向性的文库！完美支持FFPE RNA（DV 200> 25％）获得高品质的文库！

Tips:
DV ₂₀₀指的是一种评价RNA质量的指标，即长度超过200 nt的RNA片段在所有RNA序列中的比例。RNA的质量越高，DV₂₀₀值越高。

Takara分别测试了DV₂₀₀在28%-68%之间的4个FFPE RNA样本，以10 ng起始使用SMARTer Pico v2试剂盒进行文库构建。通过对样本的评估发现，无论RNA质量如何，都可以生成高质量的文库，且基本都无接头二聚体的扩增产物产生。即使DV₂₀₀低于30%（RNA样本高度降解），也能表现出较高的文库得率！

(以上数据来源于Takara Bio Inc.)

“事实说话”-用户实例分享

听了这么多，还是担心是“王婆卖瓜，自卖自夸“。选择它吧，相信我，用事实说话的，不仅仅有某著名访谈，还有SMARTer Pico v2！不仅仅有Takara严谨的数据评测，还有实力用户的真实反馈加持！

臻和（北京）科技有限公司的研发团队：
取3个不同降解程度的FFPE-RNA样本---A，B和C样本（DV₂₀₀在11%-80%之间）, 使用SMARTer Pico v2试剂盒制备文库，然后进行NGS分析。其中B样本分别以10 ng和50 ng起始，其他A、C样本均以50 ng起始。

从结果可以看出，不论FFPE-RNA的品质和起始量的高低如何，都有相当高的转录本检测数（当FPKM≥1时，转录本数均大于10,000），而且不同样本之间的一致性也非常高！其中同一样本（B样本）的不同起始量之间，即使是特别低的10 ng起始量，也显示出与50 ng起始量高度一致的数据结果！同时值得注意的是，C样本（DV₂₀₀=11%,RIN=2.5）虽然高度降解，质量较差，但转录本检测数、Q20和Q30等关键性指标仍然非常出色！

这些数据都佐证了以降解样本起始时，使用该试剂盒可以得到高品质的文库！

Input amount	A(50ng)	B(50ng)	B(10ng)	C(50ng)
DV200（%）	75	80	80	11
RIN	7.5	2.1	2.1	2.5
Total reads	54,354,978	60,432,366	58,448,242	50,730,574
% duplicates	32.9	24.6	34	18.8
transcripts≥ 1 FPKM	11,510	11,698	11,730	10,450
transcripts≥ 0.1 FPKM	20,559	19,531	19,439	22,486
Q20(%)	97.54%	97.55%	97.56%	95.08%
Q30(%)	94.13%	93.92%	93.98%	90.66%