NGS文库质检非定量PCR不可吗？

定量PCR是文库质检的神器

很多人采用定量PCR进行NGS文库质检。

文库质检是否非定量PCR不可呢？毕竟这个方法成本比较贵，操作比较复杂，时间比较长，还需要专门的精密设备。

定量PCR方法可以说浑身都是缺点，优点只有1条：测定的是可扩增的模板的量，从而为更准确地预测cluster数量，亦即测序数据量提供比较好的依据。

毕竟测序是NGS服务中最昂贵的环节，是大头，浪费起来不得了，所以在文库质检环节多辛苦一点是有必要的吧？文库质检多花点钱，是值得的吧？

一招鲜，吃遍天。

NGS文库里有什么？

就一个NGS文库而言，它里面的哪些DNA分子是可或者不可扩增的呢？哪些是可或者不可定量的呢？

注意：本文“可扩增”专指能被Illumina 文库构建引物扩增，大致相当于能在Illumina FC上形成cluster；“可定量”专指可利用商业性文库质检定量PCR试剂盒获得定量PCR数据。

1、结构完整的文库，在插入片段的两边都连接有接头：可PCR扩增，可定量检测。

2、结构不完整的文库，一边有接头，一边没有接头：不可PCR扩增，可定量检测。

3、分子结构被损害的DNA，比如FFPE样本里面的部分DNA分子、被紫外线过度照射的DNA分子：不可扩增，可以定量检测。

4、有杂质的文库和接头、引物混合物：可扩增但是扩增不充分，可定量但是定量不准确。

5、接头二聚体：可PCR扩增，可定量检测。

6、引物二聚体：可PCR扩增，不可定量检测。

7、游离的插入片段，两端都没有接头：不可PCR扩增，不可定量检测。

8、游离的接头：不可扩增，可定量检测。

9、游离的引物：不可扩增，不可定量检测。

由此可见，NGS文库的定量PCR质检数据既包含有假阳性的部分，也包含有假阴性的贡献，它并不精确等于可形成cluster（即所谓“可扩增”）的完整文库的DNA量。以此为依据来预测NGS测序数据的产量，必然存在较大误差。

你胡说！

我每天都根据定量PCR质检数据来安排文库的上机量，每次得到的测序数据都符合预期，极大地降低了返工率。这是为什么呢？

我们分两个方面来看这个问题：

第一，除了PCR-free方法外，NGS文库本身都是PCR产物，所以正常NGS文库中的DNA分子，绝大部分都是可PCR的。

第二，在文库构建过程中，包含多次磁珠洗涤步骤，既去除了杂质，也去除了小片段，包括游离的引物、游离的接头、引物二聚体和接头二聚体（按片段长度从小到大排列）。如果实验技术精湛，大部分接头二聚体都可以被去除干净。如果实验技术更加精湛，还可以去除单端连接的不完整文库，甚至还可以根据项目要求，去除插入片段过短的、不需要测序的文库。

在这种情况下，文库主要由以下两种成分组成：

1、结构完整的文库，在插入片段的两边都连接有接头：可PCR扩增，可定量检测。

2、分子结构被损害的DNA，比如FFPE样本里面的部分DNA分子、被紫外线过度照射的DNA分子：不可扩增，可以定量检测。

对于非FFPE样本，如果它又没有不小心或故意被紫外线、放射线强烈照射，则其文库中主要只剩下第一种分子，所以定量PCR质检数据是准确的。

在这种情况下，非定量PCR质检方法，比如Qubit、2100，也可以获得同样准确的文库质检定量数据，而且成本更低，速度更快，操作更简便，也不需要定量PCR仪。

小小的结论

对于正常的NGS文库，文库质检可以用定量PCR方法，但不是非用不可。定量PCR方法增加了成本，却没有带来对应的收益。