概述|病毒样颗粒的制备，看这一篇就够了！

 

图 Web of scinece 中以“virus like particle”为主题检索的文献数量

生产基于VLPs的生物药物，关键在于能够大规模制备得到高质量的VLPs。VLPs的制备主要包括病毒结构基因的克隆与表达、选取宿主表达系统、纯化、鉴定等几个环节。

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病毒结构基因的克隆与表达

重组VLPs的构建要符合几个原则：VLPs的构建需要基于对相应病毒的基础研究；可以合成获得衣壳蛋白的基因序列及外源功能肽的基因序列；外源功能肽的基因能够嵌入载体衣壳蛋白的基因且不影响VLPs的自组装；VLPs能够在宿主细胞中表达；新构建的VLPs应该具有相比原有病毒显著的优越性，例如高的生物活性，高表达量等。VLPs构建的第一步是克隆必要的结构基因，而目前大量病毒的基因通过数据库即可获得，这也为VLPs产品的开发提供了基础条件。

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选取宿主表达系统

构建一个新的VLPs的关键因素之一就是选择表达系统。主要的宿主表达系统中，细菌系统占最主要地位，其次是昆虫表达系统和酵母系统，植物和动物细胞表达系统通常用于确保表达的VLPs具有特定的性质。决定VLPs表达成功的关键不仅在于其基因构建，更在于选取的表达系统。表达系统的选择要考虑到实际表达出的VLPs是否能具有预期性质，同时要考虑表达量及下游生产成本。

图 现有主要表达系统的比较

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 纯化

为了保证构建与合成的VLPs保持颗粒的完整性以用于下游的应用，选择合适的纯化方法同样重要。VLPs的纯度、效力、一致性对最终VLPs产品质量至关重要。对于大规模生产，要求整个工艺具有产量高、时间短、收率高、可放大性和稳定性。由于VLPs的颗粒性质的挑战，纯化步骤一般越简单越好。通常VLPs的纯化步骤包括：

（1）破碎细胞以释放VLPs

破碎的方法包括高压匀浆、超声破碎、反复冻融、酶处理等。对于稳定性未知的VLPs，其细胞破碎步骤所使用的条件往往需要进行优化，以避免对VLPs颗粒结构的破坏。为避免VLPs在纯化过程中的氧化及宿主蛋白酶的降解，通常会在提取缓冲液中加入螯合剂或蛋白酶抑制剂。此外，核酸酶有时会在这一步骤中加入以去除宿主核酸。对分泌型表达系统，这一步骤不是必需的。

（2）澄清

澄清的目的在于确保去除细胞碎片及其它的大颗粒聚集体。澄清步骤通常采用低速离心及膜过滤的方法。需要注意的是，在使用膜分离技术时，由于膜材料往往带有电负性或疏水基团，需要考察膜的材质是否对VLPs有吸附。

（3）中度纯化/浓缩

经过澄清后的细胞培养液中的VLPs含量往往较低，达不到所需要的浓度。此外大量的溶液体积不仅增加了储液罐的容积与成本，还会延长后续纯化的时间。因此浓缩步骤往往是必要的。浓缩的过程通常采用PEG沉淀、膜浓缩、层析等方法，在浓缩的过程中同时实现一定程度的纯化。实验室级别的纯化也常超速离心的方法，但该方法在用于大规模制备时存在处理量小、分离精度低等问题。当采用层析方法进行VLPs的捕获时，层析填料的选择至关重要。

为了解决针对病毒及病毒样颗粒纯化的瓶颈问题，目前已有采用膜色谱、超大孔贯穿孔颗粒填料及整体柱的策略进行纯化的案例，成功纯化了包括人乳头瘤病毒、番茄花叶病毒、流感病毒、腺病毒、慢病毒及各种病毒样颗粒。

中科院过程工程研究所苏志国、马光辉研究团队观察到采用传统填料进行离子交换层析时部分VLPs及病毒发生了裂解。导致其裂解的原因有多种因素，包括填料配基的种类、配基密度、甚至孔径大小[1-2]。比如，传统填料由于孔径较小，蛋白质只能以扩散方式通过填料，传质速率慢，处理量低，造成分离时间长、容易失活等问题。当蛋白质体积较大时，填料表面在吸附一层蛋白后，由于体积位阻以及静电排斥作用，会阻碍其它的蛋白质进一步进入孔内，造成填料的载量下降。另一个限制是病毒或疫苗，尤其是带有包膜的病毒或疫苗，在狭窄的填料孔径内发生吸附时非常容易发生结构变化，破坏其整体结构。

而抗原的结构发生变化以后，就会对其免疫原性产生影响，所以需要在纯化过程中尽可能维持抗原的结构。 

近年来，一些具有大孔径的膜色谱、整体柱、大孔介质等被发现对VLPs及病毒等这类具有大尺寸的生物颗粒的分离纯化具有显著优势[3-5]。如中科森辉推出的Giga Media系列产品，基质的孔径可达200 nm甚至1000 nm的水平，而一般VLPs的直径都在15-30nm左右，由于VLPs能完全扩散进入孔道结构中，因此可以获得更高的载量和更少的结构破坏。当然在这一步中，需要通过大量的小试来筛选适合捕获VLPs的填料种类及溶液条件。结合中科院过程工程研究所生化工程国家重点室多年的积累，中科森辉也可以提供VLPs纯化工艺的服务。

（4）精纯

对于临床使用的VLPs产品，精纯的步骤十分重要。残留的宿主蛋白、核酸及其它杂质需要在这一步中进一步清除以低于规定的上限。通常该步可使用亲和或离子交换层析。但若宿主杂质与VLPs具有相似的静电特性，凝胶过滤层析则是一个很好的选择。通过凝胶过滤层析可以去除样品中可能存在的聚集体以及小分子的杂质。但凝胶过滤的缺点在于处理量小、时间长。采用超滤/洗滤的方法更容易放大，也可以去除残留的小分子杂质，但膜过滤液可能存在导致VLPs聚集和吸附的问题，需要在纯化时进行考察。凝胶过滤及超滤都可将最终VLPs的缓冲液置换为储存时的缓冲体系。

（5）除菌过滤

在许多生物药物的制备过程中，终产品通常还要进行一步除菌过滤。尽管VLPs的尺寸远小于200nm，但由于杂质的减少，可能会增强VLPs在膜材料上的非特异性吸附。

此外需要注意的是，每一种VLPs在建立最初工艺时，需要关注导致产品降解的关键因素，包括VLPs本身构建时是否存在蛋白酶自剪切作用或由于缺乏部分结构蛋白而本身不稳定。

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鉴定

VLPs的分析鉴定在整个疫苗的制备过程中，从设计到纯化以及到最后的储存，都扮演着至关重要的指导作用。有研究人员指出，表达出的80%的结构蛋白都未组装成理想结构的VLPs。因此，在VLPs的上游设计和下游纯化过程中，必须要有合适的鉴定具有理想结构与生物活性的VLPs的方法，才能保证整个VLPs的制备过程不盲目浪费时间和人力物力。此外，为了满足cGMP生产要求，产品的鉴别、滴度、纯度、一致性、重复性等都需要进行。下表中汇总了为了保证产品质量所采用的部分检测方法[6]。

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结语

VLPs的生产具有一定的共性，同时由于不同VLPs的构建在结构与组成上的不同，每种VLPs的表达、纯化及鉴定方法中也会存在个性的问题。尽管VLPs的研究越来越多，水平不断提高，但其生产过程依然面临很多的挑战，包括表达过程中表达量不够，不能形成正确的组装体，纯化工程中难以同时具有高的收率与纯度等等。因此，若想获得高质量的VLPs产品，加快研发和产业化速度，需要从上游的构建方法、表达体系的选择，到纯化工艺、VLPs质量鉴定方法等方面进行综合优化。

中科森辉

中科森辉微球技术（苏州）有限公司于2014年4月8日设立，位于苏州工业园区的苏州纳米城，是一家集研发、生产、销售于一体的知识驱动型高科技公司，致力为生命科学、生物技术等领域提供国际领先的自主产品以及“一体化”解决方案。公司拥有一支卓越的研发团队和一系列自主知识产权的核心技术。技术团队来自中国科学院，核心灵魂是我国生物材料和生化分离领域的知名专家马光辉研究员和苏志国研究员。主要经营三大类产品:层析填料，层析设备，膜乳化器。