 只做了测序，没做其他实验，还能发Cell？大佬，你是如何做到的？ 不用说，肯定是生信分析，这次 Iasia依旧延续“实例讲分析”的方式边讲文献边讲分析。 今天要讲的这篇文献，底部一定会有人留言： （没想到吧，老师是会看留言的，有问题也可以向老师留言啊~） 确实，有投入才会有回报，当然是多样本才更有说服力，才能有更多的数据进行挖掘。但这并不是因果关系，有了大样本可不一定就能发高分文章。 况且对于这个水平的文章来说，101例样本绝对不算多。再加上完全不用做实验，只需要做测序与分析，不知道节省了多少时间与精力。 本篇文章在如何分析上做出了比较好的示范，大家可以仔细感受一下。 有经费、有样本的大佬，可以考虑“搞个大新闻”。 一般的研究生、博士生是没有这么多经费投入了，只能说：先收藏学习 or 请转给老板看。 （时间预警：内容很长、慢慢阅读）  文章标题：Genomic Hallmarks and Structural Variation inMetastatic Prostate Cancer 影响因子：31.398 中科院分区：1区 发表时间：July 19, 2018 DOI：https:///10.1016/j.cell.2018.06.039 文章亮点 ✴101个前列腺癌转移的深度全基因组和转录组测序 ✴串联重复影响AR和MYC的基因间调控基因座 ✴CDK12，TP53和BRCA2的失活影响不同类型的结构变异 ✴雄激素受体受到85％mCRPC突变或结构变异的影响 研究背景
文章总述  研究者选取了运用雄激素剥夺疗法（ADT）进行一线治疗后产生抵抗力的101位前列腺患者，进行了全基因组和转录组测序（覆盖范围：109X肿瘤/38X正常），然后进行整合性全基因组和转录组分析，发现了改变肿瘤发生和进展的关键调控因子的结构变异，但是这些调控因子不能用外显子测序方法检测到。 值得注意的是，研究者观察到雄激素（AR）上游624 kb的一个基因间增强子区域的扩增在81%的患者中，并且与AR表达上调相关。串联重复热点也出现在MYC附近，在与翻译后MYC调控相关的lncrna中。 研究发现，DNA损伤修复的缺陷容易导致结构变异，比如CDK12突变与串联重复、TP53失活与倒置重排和染色体碎裂的联系，以及BRCA2失活与缺失的联系。值得注意的是，大部分的SV都位于基因组间或非编码的内含子区，并没有被外显子组测序或转录组分析所捕获。与外显子组测序相比，全基因组测序(WGS)的一个关键优势是，WGS能够识别改变关键驱动基因、肿瘤抑制因子和调控因子活性的SV。 基因组结构变异SV包括基因组缺失、插入、串联重复、倒置重排和染色体间易位。SV在前列腺癌中普遍存在，在40%-60%的病例中发现了涉及E26特定转换(ETS)转录因子家族的基因融合。最近一项针对部分前列腺癌的研究显示，在5%-6%的样本中都有基因组重排。此外，先前的研究已经证实SV可以定义卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌的亚型。值得注意的是，大部分的SV都位于基因组间或非编码的内含子区，并没有被外显子组测序或转录组分析所捕获。与外显子组测序相比，全基因组测序(WGS)的一个关键优势是，WGS能够识别改变关键驱动基因、肿瘤抑制因子和调控因子活性的SV。 为了全面研究mCRPC的基因组驱动因素，研究者对100多位肿瘤患者的mCRPC样本进行了全基因组和全转录组测序，平均深度为109X，是以往大型癌症WGS研究的2-3倍。对一个大的患者队列进行深度测序，使其能够发现新的复发性SV，并确定mCRPC中这些变异的患病率。 研究者发现了以前未知的复发性SV调控肿瘤抑制因子或癌基因，发现了将非编码基因与已知的肿瘤驱动基因结合在一起的新重组，并发现了DNA修复改变与SV之间新的关联。 研究结果 一个多机构的联盟进行了一项前瞻性IRB批准的研究(NCT02432001)，该研究获得并描述了前列腺癌患者去势抵抗性转移性肿瘤活检。获得图像引导的核心活组织切片，并进行新鲜冷冻，采用激光帽状显微解剖分离富集的肿瘤标本进行RNA测序。 全基因组DNA测序是在冷冻切片上进行的，用于肿瘤和外周血的匹配正常样本，获得肿瘤的平均深度为109X，正常样本为38X，包括101例患者的结果，包括骨(n = 42)、淋巴结(n = 40)、肝脏(n = 11)或其他软组织部位(n = 8)的mCRPC病灶。 1.结构变异干扰关键的驱动基因 研究者的mCRPC肿瘤基因组拷贝数改变的频率与以前的外显子组测序报告一致。每个样本中DNA变异的百分比在7%到47%之间(中间值23%)。中值突变频率为4.1突变/Mb，略低于mCRPC之前报告的4.4突变/Mb，但大于原发性前列腺癌的0.53突变/Mb。约40%的肿瘤为三倍体大多是易位和突变。 研究者系统地识别基因组结构变异影响的区域中，最频繁的位点包含前列腺癌的关键驱动基因，强调了该疾病中构建结构变异的重要性。这包括AR、TMPRSS2和ETS转录因子(ERG)基因，它们产生TMPRSS2/ERG融合蛋白、癌基因MYC、FOXA1、磷酸酶和PTEN。  图1 对SV和mRNA表达水平进行综合分析，发现SV使肿瘤抑制因子失活。36%的肿瘤受到双等位基因改变的影响，26%的肿瘤受到单等位基因改变的影响(图2)。PTEN序列或启动子经常被易位(7%的病例)或重排(5%的病例)中断。而其他肿瘤的驱动因子如TP53、CDKN1B、RB1和CHD1的失活等位基因数量和mRNA水平之间存在显著的联系 (图2，右)，表明单等位基因的改变影响了这些基因的表达水平。  图2 2.激活癌基因的新基因融合 通过整合SV数据、mRNA表达水平和预测mRNA融合，确定了结构变异被预测激活驱动基因的情况。在的队列中有59%的人(图3)激活了ETS家族成员ERG、ETV1、ETV4和ETV5。 在四种情况下，ETS家族成员融合到以前在mCRPC中没有报道过的基因，包括由溶质载体SLC30A4和ETV4融合驱动的ETV1融合，以及TMCC2、CLTC和CDC6驱动的ETV4融合。 研究者还发现了编码基因和非编码基因之间的新融合，SCHLAP1是lncRNA，在一组侵袭性前列腺癌中高度富集。
研究这还注意到包括AXL、BRAF和MYC在内的多个涉及癌基因的低频基因融合(图1E和S3B)。基因融合将前列腺酸磷酸酶(ACPP)残基380 (NM_001009)与残基429 (NM_001699)的跨膜受体酪氨酸激酶AXL结合，产生一个帧内转录本。这些新型的低频基因融合可以代表mCRPC的治疗靶点。  图3 3.靶向基因的相关区域扩增 基因组扩增事件是基因组进化的一种机制，可以改变癌症中重要的特定驱动基因，如急性髓细胞白血病的FLT。 无偏分析确定AR上游624kb区域为mCRPC结构变化最频繁的区域。70%的病例出现AR扩增，且与显著升高的AR mRNA表达相关。这些结果与早期的发现一致，即AR扩增在原发性前列腺癌中是罕见的，但在mCRPC中很常见，是抗雄激素剥夺治疗的主要机制。MYC拷贝数扩增程度与MYC mRNA表达水平有一定的相关性 这些观察结果共同证明了全基因组测序对串联重复的无偏分析，确定了在转移性前列腺癌中驱动基因的位点，如AR、MYC和FOXA1，他们会导致疾病的进展。  图4 4.DNA修复缺陷驱动SV 为了探讨SV在前列腺癌中的病因，研究者首先统计了SV频率。SV在个体肿瘤的发生数量介于103和923之间(图5 a)。在双等位基因BRCA2突变的肿瘤中基因片段缺失明显更高 (图5B，左)。 此外，还观察到CDK12的双等位基因失活与串联重复显著增加(图5B中心，5C) 。双等位基因TP53失活与倒置重排频率升高及染色体存在显著相关。BRCA2丢失与肿瘤突变负担的统计相关性最强(平均7.0和4.0突变/Mb, p = 0.0002，图5E)。 因此，分析发现，CDK12、BRCA2和TP53的双等位基因失活与mCRPC中的三种SV形式密切相关，而TP53失活与倒置重排有关，进一步引起染色体断裂。  图5 5.DNA损伤的突变特征 带有同源重组修复缺陷的细胞会产生基因组疤痕(Lord和Ashworth, 2016)，包括删除区域两端的同源缺失。这些细胞依靠微同源介导的末端连接来修复双链DNA断裂，也称为选择性非同源末端连接。带有BRCA2双等位基因缺失的肿瘤具有微同源性的缺失水平(图6A)。  图6  图7 我们将已发表的突变特征与体细胞变异进行比较。使用非负矩阵分解来分析样本中特有的突变特征，从中发现特征8与双等位基因BRCA2失活的样本密切相关(图6A和7A)，与COSMIC 3，8非常相似(图6A和7B)，与同源重组DNA修复(HRD)缺陷相关。 这些数据证实了错配修复和同源重组中的DNA修复缺陷可以在转移性前列腺癌中产生基因组疤痕，并表明BRCA1/2复合杂合性产生了一个与双等位BRCA2失活不同的突变表型。 最后，简单总结一下这篇文章里用到的分析策略：DNA SV分析、融合基因分析 CNV分析、微同源缺失的评估、chromothripsis and chromoplexy 的评估、突变特征分析 、非编码基因的突变分析。 Iasia读这篇文章最大的感受就是：idea。可以看出这篇文章的作者对自己研究的内容在行业内的研究情况有着深刻的认知，对自己接下来要如何研究有着清晰的规划。“套路终究抵不过真情”，再多的套路都敌不过扎实的知识积累。 本篇文章并没有用特别新的技术，就是用全基因组测序（文中有说明原因）对全基因组进行生信分析，加上转录组测序验证。这是由于作者对自己的研究对象有着非常清晰的认识，而后选择了最合适的方法。 高分文章与大样本联合起来算是比较常见的搭配，但并非有了大样本就能发文章，用了新技术就能发高分文章，花了许多经费、做了大量实验就能发高分文章。Iasia有遇到一些客户，手里有几百例样本打算做测序、做分析，但他对自己研究的疾病在行业内已经被研究到了什么程度一无所知，自己的研究策略也比较模糊，手握大量样本也很难做出出色的结果。  |
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