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多发性同步肺癌（MSLCs）的诊断是临床的一大难题，很难确定不同位置的癌细胞是肺内转移还是独立原发所形成。本研究中，我们分析了来自于6个MSLC病人的15个肺腺癌和一个淋巴结转移区域组织样本的基因组谱。基因组测序结果表明15个肺腺癌组织具有不同的基因组图谱，从而证明它们是独立原发性肿瘤，这和其中五个病人的综合病理学评估结果是一致的。同一个患者体内的肺癌细胞之间，并不比TCGA数据库中那些具有相同的肿瘤大小和吸烟史不同肺腺癌患者之间的癌细胞更具有相似性。在同一患者体内不同癌细胞针对几种已知癌症相关基因具有不同的突变状态。这些发现表明即使在相同的遗传背景和环境影响下，同一个癌症患者体内不同部位的癌细胞也会由于不同分子事件的影响而存在很大的基因组学上的差异。 文章题目：Genomic heterogeneity of multiple synchronous lung cancer 研究人员：Melanoma Institute Australia, The University of Sydney，华大基因肿瘤团队 发表时间：2016/10 期刊名称：Nature Communications 影响因子：12.124研究背景 肺癌是一种异质性的疾病，不同患者甚至相同患者体内不同部位肿瘤细胞的基因组和表型特征也会存在很大差异。大量的肿瘤间异质性可能反映了肺癌患者的不同遗传背景和不同致癌物的接触。另一方面，我们团队以及其它人员关于非小细胞肺癌的研究显示大部分常见的突变都会发生在同一肿瘤内所有的区域，表明肿瘤内存在有限的异质性。像同一肿瘤不同区域一样，多发性同步肺癌（MSLC）患者体内的不同区域同时生长多个肿瘤，这些肿瘤具有相同的遗传背景和生活环境。有研究报告显示不同的MSLCs之间具有不同的癌基因突变和染色体异常。这些尚未得到充分研究的MSLCs的综合基因组异质性可能对诊断和合适的治疗至关重要。 MSLCs可能代表单一原发性癌症的血液转移，个体原发癌的单个或者多个原发性病变。2007年美国胸腔医师学院（ACCP）对统一病理学组织的MSLCs进行了分类：卫星结节（同一肺叶，无全身转移）；多发原发性肺癌（不同肺叶，没有N2-N3淋巴结血液转移）；血液扩散肺转移（不同肺叶，N2-N3淋巴结血液转移）。具有血液扩散肺转移的结节通常认为是源自于相应的原发性肿瘤。但是针对多发原发性肺癌的克隆起源却存在一定的争议，因为尚不清楚它们是来源于不同的细胞还是源于同一细胞。先前研究使用靶向标分子作为划分标记物也得到了相矛盾的结果。 为了评估MSLC基因组上的异质性和同个体内不同肿瘤之间的克隆关系，我们对六个MSLC病人的16个肿瘤样本（15个肺腺癌肿瘤样本和1个淋巴结区域转移样本）进行了基因组测序、全外显子测序结合基于微阵列的比较基因组杂交（CGH）。按照ACCP分类标准，六个病人中五个具有卫星结节，一个病人是血液扩散肺转移（Table1）。15个肺癌样本的全基因组分析显示它们具有不同的图谱，证明它们全部是原发性肿瘤。 Table1 6例多发同步肺癌患者的临床特征及测序资料 研究材料和方法 样本： 6个MSLC病人的手术切片和外周血样本( supplementaty Fig 1.)。 方法： ①全基因组测序：将样本DNA分解成500bp的片段，运用Illumina 的HiSeq 2000进行测序，平均测序深度为35 х； ②全外显子测序：样本2-6的DNA分解为150-200bp，运用Illumina 的HiSeq 2000进行测序，平均测序深度62 х； ③序列比对和突变体calling： Burrows-Wheeler Aligner，GATK，VarScan，MuTect，GATK SomticIndelDetector; ④体细胞变异验证：Mass spectrometry， Sanger sequencing; ⑤体细胞拷贝数变异识别：microarray-based CGH，Feature Extraction12.0 ⑥APOBEC 突变标志分析： ⑦统计分析：Pearson product–moment correlation test，Fisher’s exact test，Bioconductor CNTools software package。 研究结果 1 体细胞点突变： 本研究总共检测到1127个非同义编码和剪接位点突变。在这些突变中，965个提交Sequenom’s MassARRAY质谱平台或者Sanger测序的验证，876个（92%）通过验证。其余171个由于DNA剩余量不足而没有验证。这171个突变中每个只在一个肿瘤中出现。在662个非同义编码和剪接位点突变中，645（97%）个可以在Mutect和VarScan中被验证。 患者2，3和4中不同样本之间没有共有的突变，说明这些病人为多发原发性肺癌（Fig.1）。同个病人不同组织切片中也很少有相同的突变发生（Fig.2）。患者1体内的T3肿瘤与一个淋巴结转移在198个突变中共有52（26%）个相同的突变，包括KRAS（p.R305X）突变和STAG2的无义突变（p.R305X），这表明肿瘤向淋巴结发生了转移（Fig.1和Fig.2）。患者1体内其它样本的之间没有共有的突变发生，也表明该病人体内的三个肿瘤样本是独立原发性肿瘤。 EGFR p.L858R突变是患者6体内三个样本唯一共有的突变（Fig.1和Fig.2），该位点作为一个热点突变，在亚洲肺腺癌患者突变报告中40%以上都是EGFR突变。但单个热点突变的发现为确定肿瘤的独立性提供的信息是有限的。事实上，相对于在中国肺腺癌患者中EGFR p.L858R突变的整体水平，该突变在本研究中没有显著富集。因此，由于没有其它共有的突变基因，表明患者6可能有三个原发性肿瘤并相互独立携带EGFRp.L858R突变。 患者5的三个肿瘤样本测序中有两个共有的体细胞突变，样本1和2都有EGFR p.L858R突变，样本1和3都有ARHGAP35 p.E25K突变（Fig.1和Fig.2）。和患者6一样，单个EGFR p.L858R突变的出现并不表明患者5的肿瘤1和2之间存在克隆相关性。ARHGAP35p.E25K突变是病人5体内样本1和3的171个编码突变唯一共有的突变基因，这有两种可能性：（1）其中一个肿瘤是另一个转移而来的；（2）两个肿瘤独立性原发，在癌症病变中都需要ARHGAP35p.E25K突变的调节。患者1的数据和之前的研究表明原发性和转移性肿瘤之间共有突变的比例要远高于患者5中的比例，所以患者5体内的比例并不足以解释肿瘤样本1和3是原发性还是转移性关系。为了验证肿瘤样本1和3各自需要ARHGAP35p.E25K突变的可能性，将我们的数据和TCGA数据库中35个无关联的单一原发性肺腺癌患者进行比较，两组数据具有相同的肿瘤大小和吸烟情况。我们数据中共有外显子突变的比例是1/884（排除那些肺腺癌中经常突变的基因），TCGA数据库中数据的共有突变比例20/8413，（P=0.72 by Fishers exact test）。总之，数据表明患者5体内的三个肿瘤更像是独立原发性肿瘤。 为了尽最大可能发现MLSC中肿瘤的相关性，我们将突变数据集扩大到包含所有经过VarScan和MuTect验证的突变。由于经过两种算法验证的非同一突变的比率为97%，未验证的外推突变也具有很大的可能性。运用扩大的51470突变，我们并没有发现更多同一患者体内不同肿瘤样本之间的共有的突变（Supplementary Fig. 3），进一步表明6个病人的15个肺癌肿瘤是独立原发性肿瘤。 然后我们比较了16个MLSC样本与35个TCGA研究的无关联肺腺癌样本的外显子点突变。除了患者1的样本3和淋巴结转移样本，每个肿瘤之间的共有突变不多于一个。这些数据表明我们研究的MLSCs样本并不比那些分相似但期不相关病人之间具有更多的相似性。 2 已知致癌基因突变 我们接着检验了数据中癌症基因突变的模式，我们将癌症基因突变定义为和之前报道过的癌症基因或者是已知肿瘤抑制基因中截断突变相似的非同义突变。共有14个已知癌症基因在每个患者的肿瘤中都有基因点突变发生（Fig.2）。除了上面提到的EGFR突变，同一患者不同肿瘤组织之间没有共有的其它已知癌症基因，这表明同一患者不同肿瘤组织之间可能由不同的分子事件驱动形成。另一方面，三个癌症基因表明同一患者体内不同肿瘤组织具有不同的突变。患者1中，肿瘤3（伴随淋巴结转移）有一个KRAS p.G12V突变，然而肿瘤1中也具有KRAS p.G12A突变。患者1具有STK11的不同突变（肿瘤1中是p.K78N的错义突变，肿瘤2中是p.Q37X的无义突变），患者4中的EGFR突变（肿瘤1是p.L858R，肿瘤2是p.S229C）。此外，患者5中的肿瘤3中具有两种不同的PIK3CA突变：p.G1007R 和p.H1047R。 3 突变谱和突变特征 我们的样本提供了一个探索相同遗传背景和相同环境下独立肿瘤的突变过程。和之前的研究结果一致，比较有吸烟史的病人1、3的五个肿瘤样本和无吸烟史患者的八个样本发现：有吸烟史发生的突变主要为C>A，而无烟史的突变主要为C>T。六个患者体内不同肿瘤之间存在突变图谱的不一致性，患者1，2，5的统计学差异性存在显著差异（Supplementary Fig. 4），表明同一患者体内不同部位的肿瘤有不同的突变过程发生。此外，APOBEC调节是突变发生的重要过程，但是在同一患者体内却有不同的调节过程。APOBEC特征在15个样本中都出现了富集，显著富集发生在四个患者体内的7个肿瘤样本中（Supplementary Fig. 5）。 WGS为患者1的突变特征细节分析提供了充足数据。即使患者1的所有的样本作为一个整体显示了相似的突变特征（主要有吸烟相关的C>A替代驱动），但肿瘤之间具有很大的突变差异（Supplementary Fig. 6）。然而，肿瘤3和淋巴结转移相关的肿瘤几乎都具有相同的突变标签，具有代表性的就是APOBEC标记。这和最近的研究APOBEC过程常常发生在肺癌的后期阶段的结果一致。这些结果表明，即使相同的主导突变过程可能发生在不同的MSLC肿瘤发生过程，但同一患者不同部位的肿瘤仍会叠加其它不同的突变。 4 拷贝数变异 运用基于微阵列的CGH，为所有的肿瘤样本生成了SCNA序列。相比于之前的研究，样本的SCNAs较少，可能是由于肿瘤的大小和患者不抽烟或者很少抽烟相关。和之前的点突变模式相似，同患者不同肿瘤生物SCNA序列差异很大，符合这些肿瘤的独立性性质。此外，在15个肺癌和淋巴结转移样本中检测到的已知致癌基因的扩增和缺失，但同一个病人不同肿瘤之间没有检测到共有的扩增或缺失。 5 Indel和结构变异 共检测到的11个外显子的indel，每个indel只在一个的样本中出现，这和这些肿瘤样本的独立发生的本质相关。我们还根据WGS对病人1的基因组重排进行评估。除了样本3和淋巴结转移样本共有的两个缺失外，任何两个样本之间没有共有的结构变异，进一步证明了肿瘤之间的独立性（Supplementary Fig. 8）。
结论 通过对来自于6个MSLC病人的16个切片组织样本的分析，发现不同病人之间癌细胞的突变存在很大的不同，即使是相同病人体内不同部位的癌细胞也具有很大的差异性，这主要是由于癌细胞多发性的位点不同、突变类型不同。这一发现将会对MSLC病人的诊断和治疗提供较为精准的理论参考。同一患者即使具有相同的遗传背景和生存环境，但是却有不同的基因组图谱，包括体细胞点突变、拷贝数变异、染色体结构变异和突变谱。同一患者不同肿瘤组织之间的相似性不大（接近具有类似肿瘤大小和吸烟状况的肺腺癌患者之间的相似性）。这些数据证明了即使是具有相同遗传背景和生存环境的同一患者体内，不同肿瘤会产生多种不同的突变过程。另外，同一患者体内不同肿瘤样本之间也有不同的突变。这个发现使人联想到透明肾细胞癌的肿瘤内异质性，在原发性肿瘤不同克隆中同一癌症基因具有不同的突变。虽然我们的样本量比较小，但是这些样本具有相同的遗传背景和生存环境，在多发原发性肺癌中不同的肿瘤是由不同的分子事件驱动，所以围绕一定的基因或者通路做一定的筛选对一些患者的致癌原因的确定非常关键。 MLSC可能是可治愈的多发原发性肿瘤，也可能是无法通过手术切除的肺内转移肿瘤。经验性的Martini–Melamed 标准和ACCP指南广泛应用于临床指导，但是这些标准并没有一定的分子理论依据，在这项研究中我们分析了六例根据ACCP指南存在临床转移的患者（肺内转移或者卫星结节），然而，基因组分析表明6例都是多发原发性肿瘤。根据术后33个月的随访，没有一个卫星结节的患者存在复发，而患有血液型肺转移的患者（患者1）术后42个月发生了复发。以前的研究表明没有卫星结节的患者比有卫星结节的患者生存期更长。我们的数据表明，被分类为血液扩散肺转移和卫星结节的肿瘤大部分可能是多发性原发肿瘤。运用类似的方法，我们能够准确识别出六个患者中的五个，证明综合病理学评估对于大多数肺内转移与原发性肿瘤的区分是非常有价值的。肿瘤形态学特征受复杂的分子机制调控，然而我们对相关过程仍然知之甚少。肿瘤的组织学外观可以发生改变，所以不同肿瘤之间的形态相似性具有一定的指示性，但并不具有决定性。另一方面，本研究中样本的基因谱图表明，多发性原发肿瘤具有不同的基因组图谱，而转移性病变通常保留着一部分不同于来自于原发性肿瘤的基因组突变。因此，外显子水平上的全基因组谱图可以为临床和组织病理学上精确区分肺内转移与多发性原发肺癌提供重要的信息。基因组分析技术及在MSLCs的临床分期中的应用仍有待于进一步探索，如证明有效，基因组分析将成为MSLC精准治疗的一个重要组成部分。 参考文献： [1] Liu Y, Zhang J, Li L, et al. Genomic heterogeneity of multiple synchronous lung cancer[J]. Nature communications, 2016, 7: ncomms13200. |
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