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为什么说BMJ是一本神奇的杂志？对于做肿瘤侵袭转移实验的“科研民工”而言，细胞划痕实验是再熟悉不过了。但是再简单的实验也会栽跟头，这不，因为粗心大意，我前后做了两周多的无用功，在此，基于自己失败的教训，给大家做一点总结。
我为什么会选择做细胞划痕实验？
1）一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程； 2）适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3）与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。 4）简单、便宜。（重中之重） 要准备哪些材料？
做细胞划痕实验，基本上不需要额外买设备，准备：细胞样品、6孔板（基于个人实验需要）、marker笔、直尺、枪头、试剂、无血清培养基、PBS，所有需要的器材都要灭菌，超净工作台紫外线消毒至少30min。
该实验一般适用于上皮，纤维样细胞系，本身有迁移能力，且较强；有极性，方便测量，观察；对无血清有较强的忍受力。
操作步骤？
1）我习惯于在六孔板背面每隔1cm画上一条直线，方便之后镜下观察每个区域。每个孔加入5*105个细胞（可以根据牛鲍计数板确定自己合适的稀释倍数）
注：数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整；数量少时可培养一段时间至铺满板底。这就第一个坑，第一次做这个实验的时候，并没有理解铺满到底有多满，一定要等到细胞铺满，彼此之间没有空隙，否则会影响后续数据分析。
2）待细胞铺满后，用200ul枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致, 人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷，有条件的同学可以选择culture Insert（如下图），将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500um宽度的划痕
不过我查了一下价格，有一丢丢小贵，所以还是选择了枪头代替，其实多练几次，效果也是不错的，捂脸说到底还是为了省钱。 3）吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。
注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片，否则会影响拍照效果。
4）放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时拍照（观察时间根据个人实验需要）。一般为上述时间，时间太久，细胞繁殖，假阳性。
注：这是第二个坑，一般情况下，大家都会设置对照组和实验组，实验组都是加了各种抑制或促进细胞增长的药物，建议不要把观察时间设置的太长，因为很容易造成细胞污染死亡或者过度增殖造成的假阳性结果。
5）图像数据分析。我习惯于用Image Pro Plus进行分析，其实ImageJ也是可以的。打开软件，点击file→open，选择你需要处理的图片（HUVEC人脐静脉内皮细胞）。
选择区域之前，可以先对图片处理一下，加强细胞的轮廓。点击process→filters→edge→sobel→点击apply，效果如图所示。 中间黑色的划痕区域可以用描绘工具中的魔棒工具来选择。点击irregular AOI→NEW AOI，圈选中间黑色的划痕区域。 接下来开始测量，除了测量面积之外，还可以测量外框长度，也就是划痕的长度，也就是图片的整体高度。点击count/size→measure→select measurements→Box Height（这就是划线的长度）。 点击edit→convert AOI(s) to Object(s) →view→meaurement data。 划痕的平均宽度=Area/Box Height，例如图中数据654727/1200≈545.61
注：一个要注意的问题，随着细胞的不断迁移，划痕会不断缩小，在计算不同时间点划痕宽度的缩小时，不要计算其相除的比例值，而是要计算想减的差值。
好了，今天就策到这里，希望对大家有帮助。 |
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