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微骨折是关节软骨缺损常见的外科治疗方法，微骨折手术需要在软骨缺损下方的软骨下骨钻孔，以引发骨髓间充质干细胞（BMSCs）的释放，在软骨损伤环境中使其分化为软骨细胞，从而再生关节软骨组织。然而，术后的微环境不能正确定位和引导BMSCs，导致生理功能较差的纤维软骨形成，而不是天然的关节透明软骨。3D打印技术已经用于制造具有特定形状和质量稳定的支架。为了促进软骨的修复过程，脱细胞3D打印支架可以与微骨折手术相结合，而无需第二次手术。聚糖是天然关节软骨组织的主要蛋白多糖成分，在细胞外基质中起着重要作用。在催化剂作用下，聚糖的羧基基团可与具有胺基基团的支架材料如聚乳酸-己内酯（PLCL）共价结合，便可赋予支架额外的生物特性。 今天为大家分享的是Ting Guo等人发表于《Biomaterials》（影响因子8.806）的一篇文章，本文通讯作者是来自于美国马里兰大学的John P. Fisher教授。 在本研究中，该研究团队开发了一种可3d打印的聚糖功能化支架，能为微骨折手术后释放的BMSCs提供附着场所，并能将水分、生长因子等聚集到支架表面，模拟了软骨微环境，进一步促进BMSCs的粘附聚集及向软骨分化。这种将脱细胞生物功能化支架结合微骨折手术修复软骨缺损的治疗方法，为提高再生软骨组织质量提供了一条有效的途径。 1、聚糖功能化PLCL支架的设计与表征 图1：（A）聚糖与PLCL-胺基之间的化学反应示意图。（B）核磁共振光谱证实打印后的混合PLCL、 PLGA-胺基材料、改性聚糖存在胺基。X轴显示化学位移(ppm)。（C）3D打印的PLCL-胺基支架，尺寸为 3mm×3mm×1mm。（D）在 PLCL、PLCL-胺基和 PLCL-聚糖支架上培养hBMSCs 的 DNA定量分析。7天后，聚糖支架组的DNA浓度明显升高。 N = 3，数据显示为平均值±标准差。*显示统计差异。（E）PLCL支架和 PLCL-聚糖支架压缩模量的比较。t 检验显示两组模量差异具有统计学意义(p〈0.05)。每组 N= 6。 2、离心试验评价细胞粘附及表型 图2：（A）3d打印的各组支架材料用于分离粘附和非粘附细胞。（B）流式细胞仪分析粘附细胞群。进一步量化3个阳性标记的重叠区来计数粘附的hBMSCs。在添加聚糖后，附着细胞总数提高了近 10倍。由于细胞总数增加，聚糖修饰的粘附 hBMSCs数量也增加。 3、利用兔关节软骨缺损模型进行体内实验验证 图3：（A）在膝关节滑车沟中心作一3mm×3mm全层缺损(左上)；在软骨下骨缺损的四角和中心钻5个小洞(0.75mm)(右上)；用同样大小的支架覆盖缺损区(左下)；将暴露的髌骨沟复位，用可吸收缝线缝合伤口(右下)。（B）8周后软骨缺损区修复的大体图。左上:未经处理的缺损;右上:经微骨折处理的缺损;左下:经微骨折和 PLCL支架处理的缺损;右下:经微骨折和 PLCL-聚糖支架处理的缺损。（C）术后 8 周开放性运动试验的 BBB 评分。与缺损控制组相比，所有接受手术治疗的实验组随着时间的推移得分均有所提高。动物的活动性没有受到植入物的负面影响。（D）在运动过程中测量脚的位置。所有的实验组显示更小的脚指向角度，表明在恢复过程中表现出更健康的行走方式。N = 3，数据显示为平均值±标准差。方差分析比较各组之间的显著差异。 4、对再生软骨层的厚度进行量化的3D 光学相干断层扫描（OCT ）图像 图4：(A) 健康对照组， (B) 缺损对照组，(C)微骨折组，(D)微骨折及 PLCL支架组，(E)微骨折及PLCL-聚糖支架组。沿 y 轴随机选取 10 个截面计算软骨厚度。在每个截面上，选择 x 轴上的一个随机位置进行计算。图中厚度的平均值和标准差由各组所有样本计算得到。聚糖功能化修复的再生软骨层较单纯微骨折组和未修饰支架组更厚，三维厚度分布更均匀。N = 3，数据显示为平均值±标准差。*表示组间显著的统计学差异。 5、再生软骨组织的组织学观察 图5：(A)阿尔新蓝染色显示各组产生的糖胺聚糖（GAGs）。细胞核染成紫色，周围 GAGs染成蓝色。用二元区域量化GAGs表达水平。与缺损控制组相比，微骨折组和PLCL组的组织学染色显示GAGs的产量增加。聚糖的加入进一步提高了再生组织的质量，可见排列整齐的软骨细胞被GAGs包围。(B)HE染色显示新生软骨组织。细胞核染成紫色，其余部分染成粉红色。软骨组织层比骨组织层染色更浅。计算各组软骨细胞数并进行比较。聚糖功能化组软骨细胞数明显高于其他实验组。N = 3，数据显示为平均值±标准差。方差分析比较各组之间的显著差异。 6、软骨-骨界面的组织学评价 图6：(A).Safranin-O染色显示再生软骨组织中 GAGs 的产生，红色的safranin-O染色与蛋白多糖含量成正比，Fast Green染色可中和非胶原蛋白位点，与safranin-O染色形成鲜明对比。(B)在高倍镜下(20X) ，HE染色显示缺损区下方软骨下区。与健康对照组相比，各组均显示正常的软骨下高密度骨组织。从上至下分别为健康对照、缺损对照、仅微骨折、微骨折+ PLCL支架、微骨折+ PLCL-聚糖支架染色后的代表性图片。 7、II型胶原的免疫组化染色及定量 图 7。II型胶原呈褐色。所有实验组的 II型胶原表达明显高于缺损对照组。聚糖功能化支架的加入进一步增加了再生软骨组织中 II型胶原的表达。对各组组的表达水平进行了量化。N = 3，数据显示为平均值±标准差。方差分析比较各组之间的显著差异。 8、结果与结论 本研究将3D打印生物功能化支架与微骨折手术相结合，开发了一种修复关节软骨缺损的有效方法。采用聚糖共价修饰 3d打印的PLCL支架，可显著增加BMSCs聚集粘附，并在在修复过程中最大程度模拟软骨发育微环境，促进BMSCs向软骨细胞分化，使再生软骨组织质量和关节运动功能得到巨大改善。实验结果表明，这种生物功能化的脱细胞支架具有很大的应用潜力，可以作为传统微骨折治疗的一种补充，以经济有效的方式提高软骨再生的质量，在临床上具有良好的应用转化前景。 文献来源 Ting Guo, Maeesha Noshin, Hannah B. Baker, Evin Taskoy, Sean J. Meredith,Qinggong Tang, Julia P. Ringel, Max J. Lerman, Yu Chen, Jonathan D. Packer, John P. Fisher, 3D Printed Biofunctionalized Scaffolds for Microfracture Repair of Cartilage Defects, Biomaterials (2018),doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.09.022. |
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