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本文由谢忠杰编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转发转载。 HIV感染导致肠道相关淋巴组织的破坏，使得肠道菌群的组成发生变化。但目前还缺乏关于HIV感染如何影响微生物与宿主之间相互作用的研究。本文结合宏基因组和宏转录组数据来研究HIV相关微生物的功能修饰。结果表明，HIV相关微生物一方面很好地适应炎症环境，例如抗氧化应激反应通路的高表达、抗炎反应过程的低表达，另一方面促进肠道炎症的发生发展。本文通过共发生网络和代谢网络，分析了群落结构中物种标记物和代谢标记物的相关性。通过贝叶斯网络，发现了维持群落结构稳定性的关键通路。此外，确定了群落中各物种对代谢活动的贡献，以及各物种和宿主健康的相互作用。 论文ID 原名：Interplay between gut microbiota metabolism and inflammation in HIV infection 译名：炎症性肠病中肠道菌群结构及代谢活动变化 期刊：The ISME Journal IF：9.520 发表时间：2018年 通信作者：María José Gosalbes、Andrés Moya 通信作者单位：西班牙研究团队 背 景 HIV全称为人类免疫缺陷病毒，为逆转录病毒科、慢性病毒亚科，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。HIV病毒颗粒呈球形，直径100-120nm，与CD4+受体细胞有亲和力。HIV病毒是二倍体病毒，其基因组由2个相同分子的正链单股RNA组成，病毒内部有逆转录酶、蛋白酶、整合酶。 获得性免疫缺陷综合症是由HIV引起的一种传染性疾病，抗逆转录病毒治疗（ART治疗）的出现大大降低了HIV感染者的发病率和死亡率，但治疗效果在感染人群中有差异：有些患者在ART治疗后1-2年时间免疫系统功能得到一定程度恢复，称为免疫应答者（IR）；但有些患者在ART治疗后1-2年时间免疫细胞的功能未得到有效恢复，称为免疫无应答者（INR）。 HIV感染是一个全球性的流行病。HIV侵入并破坏人体的正常免疫系统，导致肠道微环境平衡被破坏，改变肠道菌群组成以及代谢，破坏正常的宿主反应机制。目前，关于研究肠道内微生物菌群变化对HIV感染者健康的影响，已成为一个热门的研究领域。以上为本文研究工作的背景。 材料和方法 2.1 研究队列和临床指标 参考引文[5]，本文研究对象为：病毒血症患者12例（VU=12），免疫应答者18例（IR =18），免疫无应答者9例（INR=9），以及未感染HIV的健康对照15例（HIV-=15）。关于肠道炎症、肠道细菌移位、胸腺功能、T细胞活化的生物标记物也在引文[5]中有论述。 2.2 DNA/RNA提取和测序 参考引文[5]，本文的测序实验完成于西班牙瓦伦西亚公共卫生研究中心，序列数据文件上传至EBI数据库，编号为PRJEB23871。 2.3 宏数据处理和生信分析 宏数据处理的思路如下：1）针对数据预处理，二代测序产生宏基因组和宏转录组数据，对DNAseq和RNAseq的原始数据去除低质量序列和宿主基因序列等预处理操作。2）针对序列拼接，宏基因组序列拼接使用Ray-Meta工具，宏转录组序列拼接使用Trinity工具，得到叠连群。3）针对基因预测，宏基因组ORF鉴定使用MetaGeneMark工具，宏转录组ORF鉴定使用TransDecoder工具，工具介绍请参考引文[33]。4）针对功能注释，宏基因组和宏转录组的功能注释均使用rapsearch2工具比对KEGG数据库，得到基因家族信息和基因通路信息。5）针对物种注释，宏基因组和宏转录组的物种注释均使用blast工具比对Genomeclustdb数据库。 生信分析的思路如下：1）使用LEfSe方法来识别物种标记物和代谢通路标记物。2）使用广义线性模型GLM，将通路标记物作为响应变量，将物种分布作为预测变量，研究各物种与HIV相关代谢通路之间的相互作用。3）使用hmmsearch和blast工具比对ORFaanr数据库，实现敏感性分析，研究HIV引发炎症有关的代谢途径。4）其他关于生态学、聚类、排序、相关性分析等方法的介绍，请参考本文的补充材料。 2.4 基因表达分析 基因丰度的计算方法：基于宏基因组序列数据，使用soap工具比对ORFaanr数据库，计算各基因片段的丰度，流程请参考引文[37]。转录本丰度的计算方法：基于宏转录组序列数据，使用RSEM工具比对ORFaanr数据库，再根据测序深度和转录本长度，计算各转录本的表达量/丰度，数学单位FPKM。基因表达分析：通过计算各个功能基因的RNA/DNA丰度比值，来定义过表达基因或低表达基因，显著性分析使用t-检验和BH校正，方法请参考引文[15]。 2.5 生态网络和代谢网络 生态网络的构建方法：基于DNAseq和RNAseq的物种注释数据，生态网络中包含平均丰度大于0.01%且出现在70%以上样本的物种。使用SparCC工具计算物种之间的相关性。使用igraph工具编辑共发生网络。代谢网络的构建方法：基于DNAseq和RNAseq的功能注释数据，代谢网络中包含宏基因组显示的通路和宏转录组显示的通路。使用KEGG-graph和igraph工具编辑代谢网络。关于网络拓扑属性，介数、度数、特征向量中心性，网络碎片化等方法的介绍，请参考本文的补充材料。 2.6 多组学贝叶斯网络 基于宏基因组、宏转录组和代谢组数据，使用贝叶斯网络方法来预测T细胞活化、胸腺功能、细菌移位等对菌群的影响。关于马尔可夫毯概念：针对贝叶斯网络中任意一节点，其马尔可夫毯包含了它的所有信息，而非马尔可夫毯被认为是它的冗余信息。 实验结果 3.1 肠道菌群与HIV关联的宏基因组 基于宏基因组数据，参考图1a，NMDS聚类分析结果表明，HIV+组和HIV-组样本中KO基因含量的差异性很大。其差异性同样体现于各个患病HIV+组（VU组、IR组、INR组）和对照HIV-组的比较中。接下来使用LEfSe工具来分析微生物组间差异。参考图1b，发现34个KEGG通路、186个KEGG直系同源基因可能是导致组间差异的基因和通路标记物。例如，HIV+样本菌群表现为促炎症反应通路（ko00540、ko05111、ko05120）的增加，抗氧化应激反应通路（ko00250、ko00908）的增加，而信号转导和膜转运通路的减少。 图 1 微生物组间差异不仅体现在功能方面，物种方面也有所体现。HIV+样本菌群表现为Prevotella、Acidaminococcus、Streptococcus等菌属的增加，而Bacteroides、Bifidobacterium、Akkermansia、Odoribacter、Alistipes等菌属的减少。 3.2 肠道菌群与HIV关联的宏转录组 基于宏转录组数据，参考图3a，NMDS聚类分析结果表明，HIV+组和HIV-组样本中RNA-KO基因含量的差异性很大。接下来使用LEfSe工具来分析微生物组间差异。参考图3b，部分结果如下，HIV+样本菌群表现为应激反应通路（ko04141、ko00521、ko00730、ko00053）的转录本丰度增加，而抗炎症代谢过程（ko00650、ko00640、ko00071）的丰度减少。 图 3 本文计算log RNA/DNA丰度比值，来确定差异表达（过表达或低表达）的基因。结果发现，HIV+组中49.08％的基因差异表达，其中13.89%过表达；而HIV-组中40.61％的基因差异表达，其中11.90%过表达。参考图4，差异表达基因结果表明，HIV+样本菌群表现为应激反应通路（ko00730、ko00521、ko4141）的过表达，而抗炎症代谢通路（ko00640、ko00650）的低表达。因此宿主的局部炎症反应，可能致使微生物优先表达那些减弱氧化应激反应的代谢通路。 图 4 基于宏转录组数据的物种注释结果，HIV+样本菌群表现为Prevotella、Acidaminococcus、Coprobacillus、Streptococcus等菌属的增加。这些被认为是转录活跃细菌。 3.3 肠道菌群与HIV关联的生态失调 使用广义线性模型GLM分析，发现HIV+组中细菌物种标记物与通路标记物为正相关。该方法评价了物种标志物是否携带与其正相关的通路标记物的基因，或者促进具有代谢功能的群落细菌的生长。本文发现物种标志物提供了涉及其相关代谢通路的基因，而且普氏菌属各个菌种都提供了涉及HIV相关通路的基因，表明普氏菌属在HIV发病过程中的重要作用。 3.4 肠道菌群与HIV关联的生态网络和功能网络 共发生网络和代谢网络可以研究群落中生态和功能的相互作用。参考图6a，肠道菌群与HIV关联的共发生网络体现了连通性分布和小世界效应等性质。参考图6b，该网络产生了20个模块，各模块都包含3个以上物种，最大模块包含34个物种。大多数模块的主导细菌为厚壁菌门与拟杆菌门，少数模块的主导细菌为放线菌门和变形菌门。结果还发现，如果模块中包含双歧杆菌属（放线菌门），则该模块中不存在变形菌门，推测放线菌门和变形菌门有竞争关系。 图 6 除了讨论共发生网络，代谢网络也展示了3700种酶和31725条互作关系，结果发现了KO标记物是代谢网络的核心，揭示了其与HIV微生物代谢过程的相关性。 3.5 肠道菌群失调和宿主健康 基于宏基因组、宏转录组、代谢组、临床指标等数据，使用贝叶斯网络来研究肠道菌群失调对HIV免疫发病机理的综合影响。本文贝叶斯网络（临床指标、功能基因）包含190个节点和548条连线。结果发现，代谢相关通路的马尔可夫毯与临床指标有很多联系。参考图7，针对丁酸代谢的马尔可夫毯（丁酸MB），总共包括89个节点，其中16个是临床变量节点，而且与丁酸代谢有直接联系的是炎症（hs-CRP）、细菌移位（BPI）、内皮功能障碍（ADMA）、凝血（D-dimers）等标记物。结果还发现丁酸代谢与丙酸代谢通路（ko00640）呈现正相关，与脂肪酸代谢通路（ko00071）呈现正相关，与Nadir CD4+T细胞数目呈现负相关。结果还发现CD4+T细胞数目与鼠胆酸含量呈现正相关，已知鼠胆酸在HIV患病人群中过量表达。结果还发现，免疫激活标记物例如HLA-DR+CD38+CD4+T细胞、HLA-DR+CD38+CD8+T细胞，与齐墩果烷型三萜代谢物、各种膜结构脂质均呈现明显的负相关。 图 7 讨 论 本文通过解读微生物组学的研究成果，帮助改善临床治疗效果，并且指导新疗法的开发。请参考本文Disscussion部分内容。 评 论 本文作者首先回答了HIV感染后的人体肠道菌群中细菌的种类和细菌参与的代谢过程，其次回答了与HIV疾病关联的细菌种类、基因表达和基因功能，然后使用网络方法研究了肠道微生物群落的内外关系。网络分析具体如下：基于宏组学数据的物种注释信息，可以做生态网络分析；基于宏组学数据的功能注释信息，可以做代谢网络分析；基于宏组学数据、代谢组数据以及临床指标，可以做贝叶斯网络分析。 小编认为感兴趣的读者可以：1）琢磨社交网络/生态网络/生物网络的一般性质；2）使用R/Python/CytoScape软件实现网络的可视化；3）讨论酶的网络图（功能基因的网络图）是否有研究价值。同时欢迎读者朋友与小编反馈意见并讨论想法。 主要参考文献 [ref5] S. Serrano-Villar, et al. The effects of prebiotics on microbial dysbiosis, butyrate production and immunity in HIV-infected subjects. Mucosal Immunol. 2017. 引用内容；样本数据来源（引文作者系西班牙研究团队）。 [ref15] E.A. Franzosa, et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. PNAS. 2014. 引用内容；转录本丰度的计算方法。 [ref37] H.B. Nielsen et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes. Nature Biotechnology. 2014. 引用内容：基因丰度的计算方法。 [ref33] B. Hass, et al. TransDecoder (find coding regions within transcripts). 2015. 引用内容：TransDecoder工具（识别转录本序列中的编码区域）。
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