中性粒细胞在血栓形成中的作用（一）

开心100mm05xkw 2019-01-10

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★冲锋献阵★

“ 本文为2018年10月发表在《Thromb Res》杂志上的一篇综述类的文章。该文章为目前关于中性粒细胞在血栓形成过程中所起作用机制方面最新最全的综述。受篇幅限制，本文将分3-4期连载，敬请广大读者持续关注。在此，也对颜清老师的辛苦编译，表示感谢。”

概况

2010年，血小板、凝血因子、纤维蛋白原和单核细胞被报道参与血栓形成过程。在此之前，尽管种种迹象表明中性粒细胞在血栓形成过程中具有重要作用，但仍存争议。

过去十年中，随着几项相关研究的进展，中性粒细胞在血栓形成过程中起到重要作用的观点也逐渐被大家所认可。中性粒细胞可通过释放中性粒细胞胞外捕网(NETs)促进病理性动、静脉血栓或“免疫性血栓”形成，而在脓毒症和恶性肿瘤等病理情况时，中性粒细胞胞外捕网就成为血栓形成的主要因素。

此外，血细胞衍生的微粒，包括中性粒细胞的微粒，与血栓的形成有关。最后，中性粒细胞中炎性小体的激活确定了其另一个在血栓风险形成中起驱动作用的重要机制。

了解中性粒细胞在血栓形成中的这些作用，可能为今后开发不影响止血的新型抗血栓药物铺平道路。

关键词：
中性粒细胞中性粒细胞胞外捕网微粒
炎性小体血栓形成免疫性血栓形成

前言

止血是维持血液流动、防止血管壁损伤后失血的生理过程，而血浆中的细胞成分(血小板、白细胞、内皮细胞)和凝血蛋白在整个过程中起到重要作用。虽然这个体系平时“不动声色”，可一旦血管损伤，就会被迅速激活并诱导产生血栓。

血栓问题可能是致命的(仅次于心肌梗死、卒中)，所以更好地了解和控制这一过程中的细胞和分子机制，对新治疗方法的研发至关重要。1856年，Virchow首次列举了导致血栓形成的三个诱发因素:血液高凝性、血流瘀滞和血管壁异常(Virchow的血栓三角，见图1)。

图1.血栓形成的血栓四角。

血栓形成的发病机制是基于Virchow的三联征，包括瘀滞、高凝和内皮功能障碍。大量的数据表明，免疫失调在血栓形成过程中扮演着重要的第四种角色，因此值得被纳入潜在的“血栓四角”。NET=中性粒细胞胞外捕网。

当时，相关的细胞机制尚不为人知。1881年，Bizzozero首次描述了血小板及其在血栓形成中的作用。近一个世纪后的1964年，Davie、Ratnoff和Macfarlane同时报道了在形成纤维蛋白凝块时各种凝血因子之间相互作用的顺序。

因此，血小板和血浆蛋白的作用一直是研究的热点。。血栓形成被认为是凝血因子、抗凝血因子和纤溶机制的紧密平衡被后天或遗传的危险因子破坏的结果。从2005年开始，我们才对血栓的形成过程有所理解，当时Gross等人报道白细胞在受伤后2-3分钟被聚集到一个正在生长的血栓中，并且随着时间的推移而增加。

Darbousset等人证实了这一点，他们证明了在动脉损伤部位通过细胞内粘附分子-1 (ICAM-1)/白细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)相互作用积聚的第一个细胞不是血小板，而是中性粒细胞。因此，又过了一个多世纪，单核细胞和中性粒细胞作为动、静脉血栓事件中血栓形成前状态的重要作用才为人所知。

中性粒细胞是最丰富的白细胞，构成我们对感染性病原体先天免疫的核心。它们是控制感染和帮助清除细胞碎片的第一道防线。它们的抗微生物活性是通过细胞内的含氧和不含氧机制进行杀灭(吞噬)的。因此，近年来中性粒细胞在血栓形成中的作用一直是人们关注的焦点。

中性粒细胞耗竭对血栓形成的抑制作用以及小鼠静脉血栓中高中性粒细胞脱氧核糖核酸(DNA)含量为中性粒细胞可能在血栓形成中发挥重要作用提供了初步线索。虽然在血栓中存在中性粒细胞很久前已经为人所熟知，但它们在血栓形成过程中的确切机制作用还未被发现。目前的研究表明，中性粒细胞胞外捕网 (NETs))和中性粒细胞来源的微粒(NMPs)有均助于血栓形成。

1.1中性粒细胞胞外捕网 (NETs))
1.1.1.中性粒细胞胞外捕网病理学

NETs在血栓形成的过程中最广为人知的机制是：中性粒细胞促进血栓的形成。Brinkmann等人于2004年首次发现NETs 结构，描述为由染色质和粒状蛋白组成的细胞外结构，具有抗菌特性。在那个时候，致使NETs 形成的确切机制还不清楚。

目前大量积累的数据便于我们更好的了解NETs 的形成和特征，包括其抗菌、抗真菌特性、促凝血性质以及其在自身免疫紊乱和癌症中的作用。

两种不同的NETs形成机制已被阐述: NETosis是中性粒细胞经历一种新形式的程序性细胞死亡和释放NETs的过程。这个过程很慢，可能需要几个小时。在NETosis过程中，中性粒细胞通过依赖于肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD4)和其他中性酶的染色质去致密化。

虽然这可以防止感染在血管内扩散，但过度激活可能导致病理血栓形成(免疫血栓形成)和自体免疫。

中性粒细胞迁移到感染部位是由炎症介质引起的，炎症介质增强内皮细胞Eand P-selectins的表达，导致中性粒细胞粘附，继而滚动。随后，趋化因子影响中性粒细胞表达与内皮细胞上ICAMs结合的整合素，并侵入感染组织。

除细菌或真菌外，多种刺激物如白介素-8 (IL-8)、脂多糖(LPS)、活化血小板或内皮细胞、尿酸单钠晶体和各种自身抗体都可引起 NETosis。这些触发物通过还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(在 NETs的释放中起关键作用)，导致活性氧(ROS)的形成。

在无 NETosis的环境中，NADPH氧化酶在 NET生成过程中的重要作用显而易见，慢性肉芽肿病(CGD)，其特征是NADPH氧化酶缺陷，二苯碘铵(NADPH氧化酶抑制剂)和外源性过氧化氢酶(H2O2降解)抑制NETosis的一组遗传性疾病，并在H2O2的生理浓度下诱导 NETs。

核肿胀是NETosis过程中观察到的第一个形态学改变，由PAD4触发。PAD4对NETosis的启动至关重要，因为它将组蛋白H3和H4上的精氨酸残基高瓜氨酸化，导致它们失去正电荷，从而导致染色质去致密化。PAD4缺陷小鼠的中性粒细胞不能形成 NETs。

虽然粒状中性粒细胞弹力酶、细胞质丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin B1等其他中性粒细胞酶也易位至细胞核，可能触发染色质去致密化和 NETs释放，但其确切作用尚待证实。在这个过程的最后，含有DNA和组蛋白的 NETs在中性粒细胞激活后大约45-240分钟被释放。

第二种机制，重要的NETosis，被描述为一种不会导致细胞死亡的更快的过程。因此，中性粒细胞能够保持其运动和吞噬的能力。

Yousefi等人首先在嗜酸性粒细胞中描述了类似的过程，他们发现嗜酸性粒细胞无需经历细胞死亡就可在短时间内释放线粒体DNA。这种机制后来在嗜中性粒细胞中也被描述，介导于toll样受体-4 (TLR4)，随后被微生物特异性分子模式激活。该模型从完整的中性粒细胞中挤出DNA、组蛋白和丝氨酸蛋白酶。

1.1.2. NETs和静脉血栓形成

脉血栓栓塞(VTE)仍然是发病率和死亡率的主要原因。最近研究发现，嗜中性粒细胞在静脉血栓形成中的促凝血作用中更加明显。NETs可以通过不同的机制促进血栓形成。

如上所述，激活的NETs是由DNA和组蛋白组成的基质。该基质提供了支架，并与红细胞和血小板等细胞成分结合。细胞外DNA网促进血小板活化、血小板聚集和血栓形成(图2)。

图2. NETs 的形成及其在血栓形成中的作用。

NETs 的形成有两个过程:非裂解或活性的NETosis和裂解NETosis。PAD4引起组蛋白的高瓜氨酸化，导致染色质去致密导致核肿胀，随后释放含有DNA和组蛋白的NETs。裂解性和非裂解性NETs均可引起血栓形成。NETs的负电荷表面促进凝血内源性通路的激活。net上的TF激活凝血的外源性通路。组蛋白激活血小板(通过vWF介导的相互作用)，抑制凝血调节素，促进血栓形成。中性粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶抑制TFPI，一种抗凝血剂，支持血栓形成。肝素、DNA酶、APC、PAD4抑制剂、p -选择素抑制剂和重组ADAMTS13是抗血栓形成的药物，其潜在的新机制如上图所示，基本上是基于NET抑制。APC=活化蛋白C, DNAse=脱氧核糖核酸酶，NET=中性粒细胞外捕网，PAD4=肽酰精氨酸脱亚氨酶, PSGL= p -选择素配体1,RBC=红细胞，TF=组织因子，TFPI=组织因子通路抑制剂，TM=凝血调节素，vWF=von willebrand因子，WP=weibel-palade小体。(有关本图例中颜色的说明，请参阅本文的web版本。)

体外研究表明，血小板与DNA结合，并被组蛋白激活，分别是NETs的两种成分。虽然血小板与NETs 相互作用的确切机制尚不清楚，但vWF的A1域相互作用被认为是vWF与组蛋白结合的可能机制。

这个理论被发现于Brill 等研究的由下腔静脉流动限制引起的深静脉血栓形成（DVT）的小鼠模型。表明瓜氨酸化组蛋白H3 (citH3)出现在 NETs与vWF和促进红细胞和血小板丰富血栓。组蛋白激活血小板的可能机制包括刺激血小板TLR2和TLR4受体。

当样品经脱氧核糖核酸酶(DNase)处理后，中性粒细胞外捕网与血小板相互作用无效。因血液中 NETs的溶解，所以在肝素抗凝血中这种相互作用也会丢失。血小板通过糖蛋白Ib (GPIb)与中性粒细胞相互作用形成活化血小板，进一步促进NETosis。这种恶性循环促进血栓的形成。

NETs还通过激活凝血级联增加静脉血栓形成(图2)。NETs 中存在的细胞外核酸可以增强凝血因子的蛋白酶活性，诱导凝血酶生成。Von Bruhl等人证明，NETs可激活因子XII导致本底通路的激活。此外，最近的研究也描述了因子XII本身是如何通过启动组蛋白瓜氨酸化来促进NETs 生成的。

在这项研究中，Stavrou等人通过尿激酶纤溶酶原激活剂受体介导(uPAR介导)Akt2在S474位点磷酸化，展示了中性粒细胞中的FXII信号是如何产生NETs的。因此，阻断FXII-uPAR与uPAR肽的相互作用或使用特异性AKT2抑制剂，在中性粒细胞接受FXII治疗时，可显著减少NETosis。