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肉毒神经毒素BoNTs是对人类具有极高毒性的一种致毒物质，被认为有潜在的生物武器的威胁 。BoNT主要进攻的是神经系统，它可以阻止神经递质正常的行使功能。目前对于这种毒剂的抑制剂开发一直比较困难市面上已经存在的治疗方案都很难中和它的毒性作用，甚至连结合这一蛋白都有困难。因此开发一种有效的抑制手段是当务之急。由于BoNT在体内的作用时间很长，所以可逆的抑制手段不能很好的起作用，那么只能用共价结合的不可逆相互作用才能有效的抑制这一蛋白的毒性。小分子的共价抑制剂就是首选。但目前市面上对于这一蛋白的小分子抑制剂极少，本篇文章就开发了一种可以筛选BoNT小分子抑制剂的方法，并找到了可以长效抑制BoNT的小分子。 BoNT上有三个Cys，其中两个Cys活性比较高，另外的一个430位Cys在末端形成二硫键稳定结构，另外两个活性Cys分别位于135位和165位。想要开发不可逆的抑制分子，这些活性的Cys就是很好的靶点。为了检测小分子对于这两个Cys的作用能力，本篇文章选用碘乙酰胺的荧光探针（5-IAF），他们通过将两个Cys位点突变验证了这一荧光探针特异性的结合在这两个Cys上，接下来他们测试了IAF的竞争效果，他们选用了Cys常见的活性反应小分子NEM作为对照组，用5-IAF去竞争，能看到明显的浓度依赖的信号。证实了这一个方法的有效性。 由于165位的Cys更靠近活性位点，文章中先对特异性结合165位点的小分子进行了筛选。他们分别在浓度梯度和时间梯度的层次上进行了实验。他们对700个小分子进行了筛选。他们发现能够产生竞争的小分子大部分都带有活性的硒元素。他们认为这一现象的可能解释是165位的Cys反应活性较低，之前的研究中也猜测165位的Cys以硫醇的形式存在，因此与其反应需要更高的亲电性。在他们鉴定到有效果的小分子中有一个很常见的药物ebselen，这一药物之前曾被认为是通过抗氧化来行使功能，但未被报道有Cys反应活性。文章中挑选这一个已经商用的小分子对结果进行了验证。 他们首先在体外用这种小分子处理蛋白，并用IAF竞争，确实存在竞争的效果，而且在把Cys逐一突变后这种竞争就减弱了，两个Cys都被突变后这种竞争就会消失。随后他们在体外构建了测定BoNT酶活的体系，并用这一体系证实了ebselen可以抑制BoNT酶的活性。随后他们进行了突变实验证实了ebselen抑制BoNT酶活性的能力是依赖于BoNT上的Cys的。此外他们还测试了ebselen对于BoNT抑制作用的时效性。他们发现ebselen确实可以很有效的抑制BoNT，并且这种抑制效果非常持久。最后他们在神经体系中测试了ebselen的效果，他们发现ebselen确实可以有效的抑制BoNT的毒性。 本篇文章开发了基于IAF荧光探针的ABPP技术对BoNT的共价抑制剂进行了筛选，成功筛选出了多个抑制剂，这些抑制剂都有活性的Se元素，其中ebselen可以长效的抑制BoNT的毒性，防止其对神经系统的损害。 本文作者：LZH |
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