癌症早筛、监控“利器”——揭秘液体活检技术“循环游离DNA”

液体活检技术，由于其非侵入性取样特性，是检测肿瘤、辅助治疗的突破性技术，特别是来自血浆的循环游离DNA (Circulating free DNA or cell free DNA, cfDNA)检测，正迅速成为标准肿瘤活检的重要微创辅助手段，甚至可能是一种潜在替代方法。到底什么是液体活检？cfDNA又有怎样的技术优越性和目前的最新临床研究？以及我们如何给临床提供相关的检测服务？今天小编详细道来。

监测利器——循环游离DNA(cfDNA)

外周血来源的cfDNA，既包括肿瘤来源的(circulating tumor DNA，ctDNA)，也包含非肿瘤来源的。cfDNA是细胞凋亡或坏死后释放到血液中片段化DNA，长度约为150-200bp，半衰期不足1小时。前期研究发现，只有当ctDNA占cfDNA中丰度的10%或以上时，才能得到准确的肿瘤信息。当然液体活检不仅限于血液检测，如尿液、粪便、脑脊液、唾液、胸腔和腹腔积液都是cfDNA的潜在来源，上述部位的cfDNA分析可能适用于特定癌症类型^[1]。

cfDNA 取样和分析

由于肿瘤释放的cfDNA的水平低，半衰期短，稳定性差等特点。所以采集样品时要采用含固定剂的专用cfDNA收集管，以稳定cfDNA和细胞，保证室温条件下储存7至14天，便于运输、存储和集中处理。目前基于PCR分析的突变特异性技术，例如ddPCR，可识别cfDNA中等位基因频率低至0.01％甚至更低的突变，当然NGS也适用于cfDNA检测。

图1 cfDNA 的提取和分析1

cfDNA最新研究进展

由于血液中的ctDNA分子含量通常远低于非肿瘤来源的DNA片段，这使得检测它们非常困难，特别是在癌症的早期阶段。

为了突破这些限制性问题，英国剑桥大学科学家Nitzan Rosenfeld带领的团队发现了血液中肿瘤和非肿瘤来源DNA片段的长度分布特征的不同。首先，他们在体外富集血浆中特定片段长度的cfDNA，然后测序，结果发现用测序结果区分来自肿瘤患者和健康人的血液样本时，曲线下面积超过0.99，而未富集的普通cfDNA检测只有不到0.8^[2]。

图2  片段特异性测序ROC曲线图

带有癌症突变的ctDNA在90-150bp区间的丰度较高，科学家们用这种片段化选择测序的方法监控肿瘤病人进展，发现比CT成像提前了2个月，而比未经过片段选择性的液体活检提前了3个月。

不过，研究者也指出在体外对不同片段长度的DNA进行分离时可能不能准确反应小于100bp和大于300bp长度的ctDNA。 希望这个片段特异富集进行液体活检的方法，未来可以尽早在临床上开展开来。

无独有偶，澳大利亚昆士兰大学Laura G. Carrascosa和Matt Trau领导的团队宣称，他们可以通过检测肿瘤组织或血液DNA的甲基化状况，在10分钟以内就能判断受试者是否患癌；而且更加令人震惊的是加入DNA之后，检测人员只需要根据颜色变化，就能判断受试者是否患癌^[3]。

Trau博士团队开发了一种胶体金试剂来指示DNA与金纳米颗粒的结合情况，试剂的原本颜色是红色，当加入肿瘤细胞DNA时，溶液会保持原来的颜色；当加入正常细胞DNA，溶液会变成蓝色。

图3  DNA与金纳米颗粒的结合图3

研究者称，这项技术现在还无法准确分辨出癌症的类型，但是可以作为一种筛查手段。这项技术简单快捷，有广阔的应用前景，希望在不久的将来能够运用到临床。

cfDNA的临床运用

1

 早期癌症检测分子诊断

由于血液中的ctDNA分子含量非常低，做到早期癌症检测非常困难。宝藤生物针对乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌和肺癌推出了“早筛1号”产品，检测特定位点的突变，利用高灵敏度无创检测技术从基因水平上评估罹患肿瘤风险。

2

分子诊断

前期研究表明，同时获得的血浆和组织样本检测关键驱动基因突变，一致度高达80-90%。宝藤生物检测有推出“监控1号” 检测患者体内相关突变基因ctDNA含量变化。

3

预后追踪监控

临床上，对于治疗实体瘤的患者，一般首选手术治疗，辅助化放疗。通过检测cfDNA浓度变化，可以使已经治愈的患者免于接受潜在辅助化疗，而对于放化疗患者可以监控肿瘤复发的可能性。宝藤生物检测有推出“监控3号”检测cfDNA浓度变化监控患者体内cfDNA含量变化。

4

耐药监控

获得性耐药通常以个体中多个耐药性亚克隆为特征，这些耐药性亚克隆可以共存于相同的病变或不同的转移病灶，cfDNA检测有助于多重耐药机制的发现。宝藤生物有诸多检测T790M、C797S、ABL、PDGFRα、K-ras和N-ras等基因突变的耐药性检测，以及采用高通量测序“监控4号”检测相关耐药位点检测。

cfDNA分析越来越多的运用于分子诊断、预后监控以及耐药检测和早期癌症检测，用于指导临床诊断，从而实现更精准的临床治疗。 宝藤生物一直致力于用最先进的技术给患者带来优质的检测服务，利用创新的研发成果，形成多组学的特色检测项目，可为临床提供肿瘤、慢病、妇幼健康和感染等各类疾病分子诊断的系统解决方案，覆盖疾病的早期风险评估、遗传易感性筛查、疾病精确分型、个体化用药指导和疾病实时监控等逾1000项专业的临床分子诊断项目，为全国100余家三甲医院开展分子医学领域的检测和科研服务。

参考文献

[1]Corcoran, R. B. &  Chabner, B. A. (2018). Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment. The New England journal of medicine 379, 2018.

[2]Mouliere, F., Chandrananda, D., Piskorz, A. M., Moore, E. K., Morris, J., Ahlborn, L. B., Mair, R., Goranova, T., Marass, F., Heider, K., Wan, J. C. M., Supernat, A., Hudecova, I., Gounaris, I., Ros, S., Jimenez-Linan, M., Garcia-Corbacho, J., Patel, K., Ostrup, O., Murphy, S., Eldridge, M. D., Gale, D., Stewart, G. D., Burge, J., Cooper, W. N., van der Heijden, M. S., Massie, C. E., Watts, C., Corrie, P., Pacey, S., Brindle, K. M., Baird, R. D., Mau-Sorensen, M., Parkinson, C. A., Smith, C. G., Brenton, J. D. &  Rosenfeld, N. (2018). Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis. Science translational medicine 10, 2018.

[3]Sina, A. A., Carrascosa, L. G., Liang, Z., Grewal, Y. S., Wardiana, A., Shiddiky, M. J. A., Gardiner, R. A., Samaratunga, H., Gandhi, M. K., Scott, R. J., Korbie, D. &  Trau, M. (2018). Epigenetically reprogrammed methylation landscape drives the DNA self-assembly and serves as a universal cancer biomarker. Nature communications 9, 2018.