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我叫林平之，是莫愁师姐的师弟，最近我要做CoIP，好烦呢！为了便宜，鲁老板让我用蛋白标签，但是应该怎么用呢？ 莫愁：首先，你要确定需要融合表达的标签是什么，不同的蛋白标签，用处是不一样的。 最常见的就是：His-Tag，Flag-Tag，GST-Tag，HA-Tag，Myc-Tag，GFP，SUMO等等。 GST-Tag是比较大的片段，主要用于GST的Pulldown，也就是用带有GST抗体的柱子，将与含有GST标记的蛋白相互作用的蛋白拉下来。（好吧说得好拗口） 大分子的标签，还有GFP蛋白，GFP基本上也是用于检测蛋白表达的，融合GFP后，可以通过GFP的荧光显示蛋白表达情况。 SUMO标签也是一种大分子标签，SUMO标签可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。 但是蛋白标签越大，会造成的对蛋白质本身的功能影响就越大，所以大分子标签一般只用于检测或者蛋白纯化等。 His-Tag，Flag-Tag，HA-Tag，Myc-Tag这些分子标签的分子量都很小，只有几个氨基酸，有很多商品化的抗体，用这些Taq主要是用来节省成本，也节约大家制备单抗所需要的时间。这些标签就是在CoIP上是最常用的。 小林子：师姐，我还遇到了一个最简单，但是又最复杂的问题，这标签……到底是要加在头上，还是尾巴上呢？ 莫愁：这个问题提的好呢……到底是把蛋白标签放到N端还是放到C端？我们要一分为二来看这个问题： 首先如果把蛋白标签放到N端，对于一些比较难表达的和蛋白太小容易被降解的蛋白，我们可以利用N端的蛋白标签。它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响，这种方法比较适合用于表位筛选。 但，凡事也有两面性，如果你要做的是分泌蛋白的话，会有这样的问题，在蛋白分泌到高尔基体的过程中，蛋白N端的信号肽，会被酶切掉……这样，你标签要是装在N端，就基本白瞎了。 那我们要怎么来分析自己做的这个蛋白有么有信号肽呢？呃，用这个网站就行了，http://www.cbs./services/SignalP/。 举个例子，首先我们找个分泌蛋白Wnt，然后我们调出Wnt1的FASTA序列： 然后bia到这个网页里： 结果是这样的： 一共有三个数值C值（信号肽酶切位点的C值比较高），S值（信号肽位置的S值比较高）和Y值（综合考量S值和C值的数值）。你可以发现，Wnt1基因的1-28个氨基酸，就是所谓的信号肽。于是你如果做IP的话，需要讲蛋白标签放到蛋白的C端。 |
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