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CHO细胞被作为治疗性抗体生产的载体的一个很重要原因是它能够产生与人类非常相似的糖基化模式，抗体的糖基化模式主要有两种方式：N-连接和O-连接。这两种糖基化模式中N-糖基化被研究的更为广泛，是由于N-糖基化可以影响重组蛋白效应子功能和细胞毒性。 小编与大家介绍CHO细胞代谢和蛋白糖基化组成之间的千丝万缕的关系，同时阐述了核苷酸和核酸糖是链接细胞代谢和蛋白糖基化的关键因素，且核苷酸和核酸糖的组成也是影响蛋白糖基化和抗体质量的关键所在，对细胞内核苷酸和核酸糖组成和浓度的分析必不可少。并且，小编跟大家介绍CHO细胞内核苷酸和核酸糖分析过程中单抗药研发人员都做了哪些工作与努力。从以下几个方面进行阐述：1. 核酸糖和核苷酸的提取。2. 核酸糖和核苷酸的分离与检测现状。3. 除了核酸糖和核苷酸定性定量分析外，关于细胞糖基化研究者们还做了哪些工作。 在整个过程中核苷酸和糖作为聚糖合成的底物，也是抗体糖基化与细胞代谢最主要的联系。CHO细胞中存在的最常见的核苷酸糖有：UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc，UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，GDP-甘露糖和GDP-岩藻糖。如图1。核苷酸糖中糖的主要来源是葡萄糖和果糖。CHO细胞可以从这两种起始糖分子中产生所有其他单糖。往往CHO细胞基础培养基中一般不会或者很少量的核苷酸，细胞内核苷酸的来源一般靠以糖和氨基酸为底物从头合成。如图2所示。 图1 CHO 细胞中主要的核苷酸糖的合成代谢途径 图2 生物体中心能量代谢与核苷酸从头合成代谢示意图（黑色部分为核苷酸） 总之，培养基中糖和氨基酸不仅对维持细胞增殖和细胞生长等生命活动起着重要的作用，而且在抗体糖基化合成过程和抗体糖基化组成中发挥重要的作用。核苷酸和核苷酸糖直接将细胞代谢与糖基化联系起来，细胞代谢不仅提供了合成聚糖所需要的糖和核苷酸从头合成的底物，还在核苷酸糖活化的过程中起着重要作用。 在抗体糖基化的过程中核苷酸糖起着至关重要的作用。如图3所示，核苷酸糖为糖基转移酶提供糖基化的糖底物，因此，核苷酸糖的可用性和浓度可以直接调节糖基转移酶反应的通量并最终调节N-聚糖合成。原因在于核苷酸糖的浓度和类型可以部分地决定糖蛋白主链上碳水化合物的结构以及与蛋白质结合的碳水化合物的单糖组成。那么控制不同类型的核苷酸糖的浓度是研究抗体糖基化组成的关键所在。如何控制不同类型的核苷酸糖浓度是抗体研发人员需要解决的首要难题，比如通过培养基补料补充核苷酸糖前体：糖和核苷酸。表1 总结了过往研发人员在补料添加中添加核苷酸和糖对于糖基化模式的影响。 图3 高尔基体中蛋白糖基化简易过程 表1 补料添加物质对于蛋白糖基化的影响
如表1 所示，在众多研究报导中证实细胞补料添加有利于改变蛋白糖基化的组成，小编认为这与补料添加改变细胞代谢和核苷酸糖的类型与浓度有着非常大的关系，那么细胞代谢与核苷酸糖的类型和浓度以及抗体糖基化组成之间具体存在着哪些关联，需要抗体研发员的不懈努力与不断创新。比如：在补料分批培养中监控细胞培养液中营养物消耗和副产物浓度变化的同时，也对分析细胞内核苷酸、核苷酸糖和糖的类型与浓度进行分析，再将这些因素的改变与蛋白糖基化组成抗体质量进行关联，构建补料添加与细胞代谢、抗体糖基化以及抗体产量与质量的预测系统。 在目标代谢物提取的过程中抗体研发人员做了很多工作来优化提取过程。对此可以总结为以下4点：1）“净”——获得细胞时保证清洗干净，提取物不被细胞培养液污染。2）“破”——保证有效的细胞破壁。3）“灭”——保证与核苷酸合成转化相关的酶（如：磷酸酶和核苷酸糖加工酶）被灭活。4）选择合适有效的提取剂提取。不同提取剂对于核苷酸和核酸糖提取的优劣势如表1所示。 表1不同提取剂对于细胞中核苷酸和核酸糖提取的优缺点总结
核苷酸分离检测与定量 CHO细胞内核苷酸糖谱分析需要对细胞内所含的核苷酸和核苷酸糖进行分离、检测和定量。目前的很多分析技术具有一定的局限性如表2所示，具体原因总结为下三点：1）很多核酸糖之间结构（例如UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖）相似，色谱分离时具有相似的洗脱时间，难以分离，2）缺乏同时检测核苷酸和核苷酸糖的方法，3）昂贵的内部定量和校准标准。在这些常用于核苷酸和核酸糖分析的仪器平台中，偶联紫外检测器具有快速和准确定量的特点但是它只能靶向分析已知核苷酸与核酸糖，对于未知的无法分析，往往在实际应用可以先使用LC-MS平台进行核酸糖和核苷酸的非靶向分析，确定目标种类后再转向紫外检测器分析。 表2 目前用于核苷酸和核酸糖定性定量分析平台的优势和局限性总结
核苷酸和核酸糖的组成和浓度是影响蛋白糖基化的关键所在，但是传统的检测分析技术对于核苷酸和核酸糖的分析具有局限性，如何弄清楚蛋白糖基化和核酸之间的关联性，研究者发现还是需要从细胞的核苷酸和核酸糖的合成代谢入手，代谢途径分析有助于阐明核酸糖合成前体（糖、氨基酸和核苷酸）对核苷酸糖水平的影响，并最终阐明它们对于糖基化谱的影响。目前，多个研究小组已采用稳定同位素标记方法来研究核苷酸糖代谢，包括不同核苷酸糖的生物合成与这些糖基化前体的转换率之间的关系。目前稳定同位素标记已成为细胞代谢研究的工具，用于识别通路瓶颈和研究细胞代谢动力学。从细胞代谢角度研究糖基化和核苷酸糖可以帮助建立预测糖基化需求的计算机模型，预测在不同糖和氨基酸添加的条件下核苷酸和核酸糖组成和浓度以及蛋白糖基化的组成。 如果我们需要更全面了解糖基化过程，非常有必要将我们的研究着落在特定糖基化前体研究上（特别是核苷酸糖的作用以及其与细胞代谢之间的关系）。尽管目前已经证明核苷酸糖浓度与糖基化效率之间存在联系，但这种相关性尚未完全量化，然而，核酸糖代谢途径和代谢通量分析有助于这种关系的量化。 在CHO细胞补料分批培养过程中，为获得更好的蛋白糖基化组成，通常补料优化方案会受到某些补料补充的成本限制，这些限制可以通过代谢研究来减轻，细胞代谢研究可以帮助找到所需补料添加的最佳量，使得补充物在整个培养过程中不被浪费。此外，代谢通量分析结合计算机模拟可用于筛选不同的更便宜的补料，这些补料可以在降低成本的同时具有类似的效果。 细胞代谢研究有助于了解细胞糖基化的过程，阐明怎样的核酸糖代谢有利于有益糖基化组成，怎样的核酸糖组成增加毒性糖基化组成，通过对核酸糖合成代谢和糖基化代谢通路的分析有助于更深入的了解糖基化过程，帮助从代谢下游指导代谢上游进行定向基因工程改造，降低有毒糖基化组成，比如一种减少6-岩藻糖基化的方法是通过敲低或敲除岩藻糖基转移酶基因而抑制岩藻糖基转移酶（FUT8）的表达；而另一种减少岩藻糖基化的方法是通过敲除或敲低岩藻糖基化生物合成途径中的某个基因的来抑制岩藻糖基合成。 参考文献： Impact of nucleotide sugar metabolism on protein Nglycosylation in Chinese Hamster Ovary (CHO) cell culture，2018. Amino Acid andGlucose Metabolism in Fed-Batch CHO Cell Culture AffectsAntibody Production and Glycosylation，2014. Synergizing metabolicflux analysis and nucleotide sugar metabolism to understand the control ofglycosylation of recombinant protein in CHO cells，2011. Metabolicengineering of CHO cells to prepare glycoproteins，2018. CHO细胞代谢知多少——氨基酸营养缺陷中国仓鼠卵巢细胞（CHO）能对重组治疗蛋白进行与内源性人蛋白质相似的翻译后修饰，帮助降低免疫原性和治疗风险，被用作生产重组治疗蛋白的首选宿主。第一个CHO细胞株是1957年由Puck实验室分离获得，经过1年的研究在1958年Puck实验室建立了我们现在所用CHO细胞最原始的细胞系，这个最原始的细胞系经过不同的基因改造、培养、训化克隆成了不同的细胞系。目前被用于抗体生产的CHO细胞系有：CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHOK1SV、GS-KO、CHOZN GS等。 图1. 表示早期“原始”CHO细胞系的产生的方案
获得更高产的重组蛋白一直是生物医药的研发人员长期努力的目标，为了达到这个目标，小编认为有三个关键点：1）、基因——选择合适的单抗生产宿主。2）、细胞代谢——工艺优化（营养供给平衡、副产物细胞毒素控制、基因影响代谢到代谢指导基因改造）。3）、蛋白分泌——蛋白合成与翻译后修饰（蛋白折叠、糖基化修饰、氨基酸供应等）。在这三个关键点中细胞代谢特别重要，但又与其他两点密不可分，基因调控细胞代谢，细胞代谢为蛋白质的产生和分泌提供物质基础，而细胞营养供给平衡又是细胞正常代谢的基础。 我们所使用CHO细胞一直表现出氨基酸营养缺陷，今天小编跟大家分享CHO细胞都具有哪些氨基酸营养缺陷。CHO细胞所需的必需氨基酸比人类（His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp和Val）所需的多得多。精氨酸被报道是维持大鼠生长和生命活动所必需的氨基酸；半胱氨酸、脯氨酸和天冬酰胺也被报道为CHO细胞特异性营养缺陷。比如：最原始的细胞株就表现出脯氨酸缺陷，必须在培养基额外添加脯氨酸来支持生长。据报道天冬酰胺营养缺陷可能是CHOK1S细胞系独有的，而不是CHO细胞的一般特征（如图2D所示）。 图2、CHO细胞系氨基酸营养缺陷型。（A、精氨酸；B、半胱氨酸；C、脯氨酸；D、天冬酰胺。圆圈表示催化关键反应酶的基因或者酶是否在CHO细胞系中存在，全部绿色代表不显示此氨基酸缺陷，绿色方块表示此催化酶在仓鼠组织中被验证） 小编观点： 细胞株的选择在整个单抗的生产过程尤为重要，一个高产、稳定副产物少的细胞株不仅会缩短上游生产工艺周期，同时有利于降低下游蛋白质分离纯化工艺过程的复杂性和成本。如何获得合适的细胞株离不开上游研发人员对现有细胞株代谢缺陷和基因缺陷的了解，俗话说知己知彼百战不殆。基因调控代谢，而代谢缺陷表型也反应着基因的调控功能，往往研发人员会先从上游入手再茫茫的非靶向改造的细胞株中挑选高产、稳定的细胞株，一步一步的研究基因改造后如何影响代谢。试想一下如果我们从细胞代谢缺陷和控制细胞副产物产生入手，通过代谢通路分析找到靶向基因，再靶向基因改造，这种从下游反推上游的思路会让我们的研发工作达到事半功倍的效果。而事实上已经有一些研发人员也做了相关工作。
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