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不知大家可有这样的经历，听大牛科学家们讲座的时候，他们经常会说：重大的科研成果来源于创造，我们不应该走老路，套路，而是应该有自己的建树，走出一条创新之路。每每听到这样的豪情壮语，我内心都是心潮澎湃，觉得自己应该用创新的思维做一件顶天立地的大事（好嗨呦，感觉人生已经到达了巅峰）。然而现实是骨感的，面对实验失败，文章难发，基金难寻，我觉得还是套路比较适合我（伤痛）。最近在阅读文献的时候，我还真发现一个非常好的套路，来自于俄亥俄州立大学综合癌症中心的文海涛（音译）博士已经用这个套路发表了多篇10+的文章，我们一起看看吧。 通过题目可以看到，这三篇文章主要讲述了糖基转移酶OGT在炎症反应，抗病毒反应等天然免疫过程中的作用，为了让大家更好的理解，我首先介绍一下研究背景。 糖类作为能量供应的主要来源，在维持机体生命活动过程中扮演着重要作用。近些年来，有报道指出在固有免疫反应发生过程中，免疫细胞的代谢途径会发生重编程，葡萄糖的摄取和糖酵解反应显著增强。除了进行糖酵解反应提供能量，细胞中的葡萄糖还能通过磷酸戊糖途径和氨基己糖合成途径合成大量代谢产物，维持机体的生命活动。通过氨基己糖途径，葡萄糖可以转变为UDP-N-乙酰葡萄糖胺，这是机体中糖基化发生的主要来源物质，在糖基转移酶OGT的作用下，能够将UDP-N-乙酰葡萄糖胺转移到蛋白的ser/Thr上进行糖基化修饰，调控蛋白的功能。 糖基化修饰作为一种重要的翻译后调控方式，在机体多种生命活动中均发挥着重要作用，但是其在固有免疫反应中的作用目前研究较少，文海涛博士就这个方向进行研究，取得了一系列重大成果，下面我们一起来看看他的研究套路。 第一篇文章于2019年3月19日发表在cell子刊Immunity杂志上，影响因子为19.734。 为了探究细胞代谢与炎症之间的关系，作者使用LPS诱导巨噬细胞发生炎症反应，随后利用质谱进行代谢组学测定，通过对代谢物进行主成分分析和基因富集分析，作者发现在炎症反应过程中，氨基己糖合成途径受到明显抑制。 为了进一步确定这个现象，作者使用Q-PCR的方法进行验证，发现当使用LPS处理后，氨基己糖合成途径中的关键代谢产物UDP-N-乙酰葡萄糖胺的含量显著降低，这表明LPS诱导炎症反应发生的过程中，的确能够下调氨基己糖合成途径。UDP-N-乙酰葡萄糖胺作为OGT介导的糖基化修饰的重要底物，作者猜想炎症反是否影响糖基化反应的发生。为了验证这一猜想，作者使用WB进行检测，发现LPS处理后，糖基化反应受到显著抑制。 以上结果暗示糖基化修饰和炎症反应的发生可能存在密切联系，随后作者构建了OGT的条件缺陷鼠进行试验，发现在巨噬细胞中特异性缺陷OGT后，LPS诱导的炎症反应显著增强，这表明LPS通过下调OGT介导的糖基化反应来诱导炎症反应。 接下来作者探究OGT抑制炎症反应的机制，通过免疫共沉淀实验，作者发现OGT和RIPK3的C端具有相互作用。先前的实验结果已经显示糖基化修饰参与炎症反应的发生，因此作者想探究OGT是否能够诱导RIPK3发生糖基化修饰以及糖基化修饰发生的位点。通过对C端的ser/thr进行逐一突变，作者发现当RIPK3的Thr467位点发生突变后，其糖基化修饰消失，这表明OGT诱导RIPK3 Thr467位点发生糖基化修饰。 机制探究清楚后，作者返回探究RIPK3糖基化修饰的功能，已经有大量研究表明RIPK3在炎症反应和坏死途径中均发挥着重要作用，那这些功能是否依赖于糖基化修饰呢？通过实验，作者发现当RIPK3 T467位点突变后，炎症反应和坏死均受到明显增强，这表明RIPK3 T467位点糖基化修饰对于RIPK3介导的炎症反应和坏死途径至关重要。 下面是第二篇文章，发表在Cell Host&Microbe杂志上，影响因子17.8： 为了探究细胞代谢与天然抗病毒反应之间的关系，作者使用VSV病毒感染巨噬细胞，随后利用质谱进行代谢组学鉴定，通过主成分分析和基因富集分析，作者发现受到VSV感染后，氨基己糖合成途径受到明显促进。 为了进一步确定这个结果，作者在体外使用VSV病毒进行感染，随后检测氨基己糖合成途径中的关键代谢产物UDP-N-乙酰葡萄糖胺的含量，发现后者的产量明显上调（这些过程是不是很相似）。
接下来作者探究糖基化修饰在天然抗病毒反应中的作用，通过OGT条件缺陷鼠，作者发现巨噬细胞中特异性缺陷OGT后，抗病毒反应显著降低，小鼠抵御病毒入侵的能力也明显下降。
随后作者探究OGT促进抗病毒反应的机制，通过荧光素酶报告基因的方法，作者发现OGT通过MAVS介导干扰素的产生，而免疫共沉淀实验也表明OGT和MAVS间存在相互作用，那这一过程是否依赖于OGT的糖基化修饰功能呢，作者构建了OGT糖基化功能缺失的突变质粒K908A，发现当OGT突变后，其后MAVS相互作用消失，这表明OGT促进抗病毒反应依赖于其对MAVS的糖基化作用。
接下来作者探究MAVS的糖基化位点，通过质谱实验，作者发现MAVS蛋白上存在多个糖基化位点，通过对这些位点逐一突变，作者发现当T365和S366位点突变后，OGT就不能诱导MAVS糖基化。为了进一步探究该结论，作者分别构建了T365和S366位点突变的MAVS质粒，发现S366位点是MAVS的糖基化关键位点。
第三篇文章于2017年3月9日发表在journal of experimental medicine杂志上，影响因子为10.79，与前面两篇类似，主要讲述OGT对stat3的糖基化修饰，这里就不再赘述了。
通过这三篇文章可以看到，这类文章的套路很清晰：利用质谱对细胞进行代谢组学检测，随后使用主成分分析和基因富集分析来探究糖基化修饰在各种天然免疫反应中的作用。机制上，最核心的问题就是探究OGT对蛋白的糖基化修饰和糖基化位点的寻找（这部分后面会给大家推荐更容易的探究糖基化位点的方法）。 虽然文章套路化可能会影响发文质量，但是对于我这种医学生来说，我的要求不高，别人发表子刊，我发几篇10分的文章就行（白日梦做多了，哈哈）。这种套路学会了吗，科研同行们，一起向10分进发吧。 |
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