(20)专利苦参治疗支原体、衣原体、真菌

​苦参中提取的生物碱在治疗支原体、衣原体和真菌引起的疾病中的药物用途的制作方法

专利名称：：苦参中提取的生物碱在治疗支原体、衣原体和真菌引起的疾病中的药物用途的制作方法

技术领域：

：本发明涉及苦参中提取的生物碱的药物用途，特别是苦参中提取的生物碱作为活性成分在治疗支原体、衣原体和真菌引起的疾病中的药物用途。

背景技术：

：支原体是一种不同与细菌和真菌的另一类微小病原体，支原体属有80余种，与人类有关的支原体有肺炎支原体(MP)、人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)和生殖支原体(MG)，前者引起肺炎，后三者引起泌尿生殖道感染。衣原体是一类能通过细胞滤器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。巳知的与人类疾病有关的衣原体有三种，分别是鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体(CT)和肺炎衣原体(CP)。沙眼衣原体主要是通过性接触传播，进入生殖道后，喜欢进入粘膜细胞内生长繁殖，在女性引起子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、尿道炎等。在男性可引起尿道炎、附睾炎、直肠炎等炎症。女性感染沙眼衣原体，会引起不孕、异位妊娠(宫外孕)、流产、死胎、胎膜早破、早产等。支原体、衣原体感染人体后，首先侵入柱状上皮细胞并在细胞内生长繁殖，然后进入单核巨噬细胞系统的细胞内增殖。由于支原体、衣原体在细胞内繁殖，导致感染细胞死亡，同时尚能逃避宿主免疫防御功能，得到间歇性保护。支原体、衣原体的致病机理是抑制被感染细胞代谢，溶解破坏细胞并导致溶解酶释放，代谢产物的细胞毒作用，引起变态反应和自身免疫。非淋菌性尿道炎约有30%~50%的病例由沙眼衣原体引起，10%~30%的病例由解脲支原体引起。支原体、衣原体感染引起的非淋菌性尿道炎(宫颈炎)目前多以干扰蛋白合成类抗生素如四环素、大环内酯类药物治疗，虽有一定疗效，但存在耐药菌株增加、复发率高、药物副作用大、用药依从性差等问题。真菌病由于致病真菌的不同，可分为角质癣菌症、皮肤癣菌病、皮肤和皮下组织真菌病、系统性真菌病和条件致病性真菌病五种。其中以皮肤癣菌病的发病率最高。而白色念球菌引起的霉菌性阴道炎，是常见的妇科病，孕妇最为常见，近年来发病率有所增长，有人统计有30~50%的妇女曾患过霉菌性阴道炎，至少75%的妇女在妊娠期患过此病。苦参SopAra^av^ce"s中含有的生物碱，主要为苦参碱(matrine)、氧化苦参碱(oxymatrine)，其次为槐果碱(sophocarpine)、氧化槐果碱(N-oxysophocarpine)、槐定碱(sophoridine)、甲基金雀花碱(methylcytisine)、安那吉碱(anagyrine)、膺靛叶碱(baptifoline)等。苦参碱和氧化苦参碱在药材中的含量之和在1.2%以上，是苦参抗菌、抗病毒、抗病原虫、抗肿瘤等作用的主要有效成分，槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱等生物碱在药材中含量也较为丰富，也是苦参的有效成分。授权公告号为CN1199674C公开了一种复方苦参洁阴冲洗液，以苦参为主药，适应症包括老年性阴道炎、滴虫性阴道炎、真菌、淋菌、细菌及支原体和衣原体性宫颈炎、阴道溃疡、绝经期阴道干枯等妇女生殖系统疾病。授权公告号为CN1270742C公开了一种具有抗菌作用的中药组合物及制备方法。该中药组合物是由黄芩、黄柏、苦参、金银花、白头翁和白花蛇舌草的活性成分提取物与药用辅料组成的口服制剂。适用于制备治疗由支原体、衣原体感染所引起的生殖、泌尿系统疾病的药物。

发明内容本发明所要解决的技术问题是提供从苦参中提取的生物碱作为活性成分在治疗支原体、衣原体和真菌引起的疾病中的药物用途。作为本发明的苦参中提取的生物碱，是指苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱或苦参总碱的一种或组合。其中苦参总碱中总生物碱含量为70.0wt%99.0wt%，苦参碱和氧化苦参碱的含量为45.0wt%90.0wt%。上述苦参中提取的生物碱的药物用途是以所述的苦参中提取的生物碱，或是苦参中提取的生物碱制成的药学上可接受的盐，加入药学上可接受的辅料，制成的任何一种剂型的药物，包括凝胶剂、栓剂、软膏剂、洗剂、胶囊剂、片剂、注射剂等，治疗由支原体和/或衣原体感染引起的肺炎、非淋菌性宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、非淋菌性尿道炎、男性不育、附睾炎、直肠炎等，以及真菌感染引起的念珠菌病、角质癣菌症和皮肤癣菌病等。本发明中的从中药苦参中提取的生物碱与化学药物相比，具有安全、毒副作用小等特点。在本发明的研究过程中，体外药效试验表明对肺炎支原体(MP)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、微小脲原体(UP)、沙眼衣原体(CT)、肺炎衣原体(CP)、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌和白色念珠菌，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱及苦参总碱均有良好的抑制作用。以下结合体外药效试验及结果对本发明作进一步描述实验一苦参中提取的生物碱抗支原体MP、UU、UP和MH的活性研究(一)供试样品样品A:苦参碱(20mg/ml)样品B:氧化苦参碱(20mg/ml)样品C:槐果碱(20mg/ml)样品D:氧化槐果碱(20mg/ml)样品E:槐定碱(20mg/ml)样品F:苦参总碱(30mg/ml)以上样品用25mMNaAc:HAc缓冲液或氢氧化钠调节pH至6左右，与培养基pH保持一致。(二)实验设计测试菌株肺炎支原体(MP)ATCC15293与MP5、MP7、MPU三株临床分离株。解脲支原体(UU)ATCC27618与UU12、UU45、UU61三株临床分离株。人型支原体(MH)ATCC23114与MH2、MH5、MH6三株临床分离株。微小脲原体(UP)ATCC27815与UP24、UP29、UP32三株临床分离株。注质控菌株来自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)测试方法微量液体稀释法(菌浓lxl()6个菌/ml)。样品终浓度与对照(红霉素作为已知有效药物对照)浓度孔l孔2孔3孔4孔5孔6孔7孔8A(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156阳性对照阴性对照B(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156阳对阴对C(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156阳对阴对D(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156阳对阴对E(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156阳对阴对F(mg/ml)7.53.751.8750.940.470.235阳对阴对红霉素Og/ml)12562.531.2515.67.33.65阳对阴对每个样品均做1:2连续倍量稀释。阳性对照每排第7孔为培养基加测试菌株。阴性对照每排第8孔为培养基加Buffer。(三)实验步骤①从第1孔至7孔，每孔加100^1培养基。②每排第8孔，培养基和Buffer各加100^1作为阴性对照。③每排第1孔加送检样品100pl，然后倍比稀释到第6孔弃去100pl。每排第1孔至7孔，各加lOOpl菌液。(四)测试结果1.对肺炎支原体(MP)ATCC15293与MP5、MP7、MP11三株临床分离株的作用样品A的MICso分别是5、5、2.5和1.25mg/ml;B的MICso分别是5、无效、2.5和5mg/ml;C的MIC5G分别是5、无效、无效和2.5mg/ml;D的MIC5Q分别是1.25、5、2.5和5mg/ml;E的MIC5()分别是5、2.5、2.5和5mg/ml;F的MIC5Q均是1.875mg/ml;红霉素的MlC5。是7.3ng/ml。2.对解脲支原体(UU)ATCC27618与UU12、UU45、UU61三株临床分离株的作用样品A的MIC5o分别是5、5、2.5和1.25mg/ml;B的MICso分别是5、5、5和2.5mg/ml;C的MICso分别是5、5、2.5和无效mg/ml;D的MICso分别是5、无效、5和5mg/ml;E的MIC5G分别是5、5、2.5和2.5mg/ml;F的MICso均是1.875mg/ml;红霉素的MICso是15.625昭/ml。3.对人型支原体(MH)ATCC23114与MH2、MH5、MH6三株临床分离株的作用样品A的MICso分别是1.25、2.5、1.25和0.625mg/ml;B的MICso分别是5、2.5、2.5和5mg/ml;C的MICso分别是5、1.25、2.5和5mg/ml:D的MICso分别是2.5、5、2.5和2.5mg/ml;E的MIC5Q分别是5、无效、5和5mg/ml;F的MIC5G分别是0.47、0.47、0.235和0.47mg/ml;红霉素的MIC5G是37.5昭/ml。4.对微小脲原体(UP)ATCC27815与UP24、UP29、UP32三株临床分株的作用样品A的的MIC5o分别是2.5、2.5、2.5和1.25mg/ml;B的MIC50分别是2.5、5、无效和2.5mg/ml;C的MIC5o分别是无效、无效、5禾Q2.5mg/ml;D的MIC5o分别是5、2.5、无效和5mg/ml;E的MICso分别是2.5、2.5、2.5禾H2.5mg/ml;F的MICso分别是0.938、0.47、1.875和0,47mg/ml;红霉素的MIC50是1.0吗/ml。(五)结论本次体外抗支原体效果试验表明对肺炎支原体(MP)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、微小脲原体(UP)，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱及苦参总碱均有良好的抑制作用。实验二苦参中提取的生物碱抗衣原体CT和CP的活性研究(一)供试样品样品A:苦参碱(20mg/ml)样品B:氧化苦参碱(20mg/ml)样品C:槐果碱(20mg/ml)样品D:氧化槐果碱(20mg/ml)样品E:槐定碱(20mg/ml)样品F:苦参总碱(30mg/ml)以上样品用25mMNaAc:HAc缓冲液或氢氧化钠调整PH至6左右，与培养基pH保持一致。(二)实验设计测试菌株沙眼衣原体(CT)ATCCVR1500与CT9、CT15、CT19三株临床分离株。肺炎衣原体(CP)ATCCVR1435与CP3、CP26、CP31三株临床分离株。注质控菌株来自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)测试方法微量液体稀释法(菌浓lxl(^个菌/ml)。样品终浓度与对照(红霉素作为已知有效药物对照)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>每个样品均做1:2连续倍量稀释。阳性对照每排第7孔为培养基加测试菌株。阴性对照每排第8孔为培养基加Buffer。(三)实验步骤①从第1孔至7孔，每孔加100nl培养基。②每排第8孑L培养基和Buffer各加100^1作为阴性对照。③每排第1孔加送检样品100^1，然后倍比稀释到第6孔弃去100nl。每排第1孔至7孔，各加100^1菌液。(四)测试结果1.对沙眼衣原体(CT)ATCCVR1500与CT9、CT15、CT19三株临床分离株样品A的MICsQ分别是2.5、5、1.25和2.5mg/ml;B的MICso分别是5、5、2.5和5mg/ml;C的MICso分别是2.5、5、5和5mg/ml;D的MIC5o分别是1.25、2.5、5和5mg/ml;E的MICso分别是5、2.5、5和2.5mg/ml;F的MIC5Q分别是0.938、1.875、0.938和0.235mg/ml;红霉素的MIC50是3.65fig/ml。2.对肺炎衣原体(CP)ATCCVR1435与CP3、CP26、CP31三株临床分离株样品A的MICso分别是5、5、2.5和2.5mg/ml;B的MIC5C分别是5、5、无效和5mg/ml;C的MICso分别是无效、5、5禾卩2.5mg/ml;D的MICso分别是5、5、无效和5mg/ml;E的MICso分别是2.5、2.5、5和2.5mg/ml;F的MIC5。分别是1.875、3.75、0.938和1.875mg/ml;红霉素的MIC5。是15.6ng/ml。(五)结论-体外抗衣原体效果试验表明对沙眼衣原体(CT)和肺炎衣原体(CP)，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱及苦参总碱均有良好的抑制作用。实验三苦参中提取的生物碱抗须癣毛癣菌、紫色毛癣菌和白色念珠菌的活性研究(一)供试样品样品A:苦参碱(20mg/ml)样品B:氧化苦参碱(20mg/ml)样品C:槐果碱(20mg/ml)样品D:氧化槐果碱(20mg/ml)样品E:槐定碱(20mg/ml)样品F:苦参总碱(30mg/ml)以上样品用25mMNaAc:HAc缓冲液或氢氧化钠调整pH至6左右，与培养基pH保持一致。(二)实验设计测试菌株须癣毛癣菌标准菌株ATCC18748与三株临床分离株。紫色毛癣菌标准菌株ATCC11902与三株临床分离株。白色念珠菌标准菌株ATCCMYA-2310与三株临床分离株。测试方法微量液体稀释法(菌浓lxl()S个菌/ml)。样品终浓度与对照(红霉素作为已知有效药物对照)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>阳性对照每排第7孔为培养基加测试菌株。阴性对照每排第8孔为培养基加Buffer。(三)实验步骤①从第1孔至7孔，每孔加培养基。②每排第8孔，培养基和Buffer各加lOOpl作为阴性对照。③每排第i孔加送检样品100^1，然后倍比稀释到第6孔弃去100^1。@每排第1孔至7孔，各加10(^1菌液。(四)测试结果1.对须癣毛癣菌标准菌株ATCC18748与三株临床分离株样品A的MICso分别是2.5、2.5、1.25和2.5mg/ml;B的MICsq分別是5、5、2.5和2.5mg/ml;C的MICso分别是2.5、5、5和5mg/mhD的MIC50分别是无效、2.5、5禾B5mg/ml;E的MICso分别是5、1.25、5和2.5mg/ml;F的MICso分别是0.938、1.875、1.875和0.938mg/ml;红霉素的MIC5o是3.65pg/ml。2.对紫色毛癣菌标准菌株ATCC11902与三株临床分离株样品A的MICso分别是5、5、无效和2.5mg/ml;B的MICso分别是5、5、无效和5mg/ml;C的MIC5o分别是无效、5、5和5mg/ml;D的MICso分别是5、5、2.5和5mg/ml;E的MICso分别是2.5、1.25、5和2.5mg/ml;F的MICso分别是1.875、3.75、1.875和3.75mg/ml;红霉素的MIC50是3.65ng/ml。3.对白色念珠菌标准菌株ATCCMYA-2310与三株临床分离株样品A的MIC5Q分别是1.25、5、2.5禾Q2.5mg/ml;B的MIC50分别是2.5、5、无效和5mg/ml;C的MIC50分别是5、5、5禾卩5mg/ml;D的MICso分别是5、2.5、1.25禾Q5mg/ml;E的MIC50分别是2.5、5、5和2.5mg/ml;F的MICso分别是1.875、1.875、0.938和1.875mg/ml;红霉素的MICso是3.65ng/ml。(五)结论体外抗真菌效果试验表明对须癣毛癣菌、紫色毛癣菌和白色念珠菌，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱及苦参总碱均有良好的抑制作用。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。实施例1苦参总碱的制备方法将符合中国药典规定的苦参10kg去泥、沙及其他杂质后粉碎待用。用浓度为0.2%的盐酸100L对所述粉碎苦参进行渗漉，收集渗漉液。用氨水将所得渗漉液的PH值调至7，此时有沉淀物析出。滤除此沉淀物，收集滤液。所得的滤液通过体积为10L的110型阳离子交换树脂，然后用5%的氨水50L将树脂上的吸附物洗脱，收集洗脱液。回收氨，将洗脱液浓縮至干，得苦参总碱152g。实施例2苦参总碱的含量测定1.滴定法取苦参总碱样品约0.15g，精密称定，加0.2moI/L盐酸溶液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠6g与lmol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用氯仿振摇提取5次(25、20、10、10、10ml)，每次氯仿提取液均用同一氯化钠饱和溶液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠lg的脱脂棉层滤过。合并氯仿液，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的氯仿，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液(O.lmol/L)滴定。每lml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于26.44mg的C15H24N202。测得苦参总碱含量以氧化苦参碱计为85.7wt%。2.高效液相色谱法色谱条件与系统适用性试验以氨基键合硅胶为填充剂；乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(81:10:9)为流动相；检测波长为220nm。理论板数按氧化苦参碱峰计应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品适量，分别加乙腈-无水乙醇(80:20)溶解，制成每lml含苦参碱0.0266mg,氧化苦参碱0.2628mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取苦参总碱样品约O.Olg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氯仿25ml，称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀；精密量取5ml置IOml烧杯中，于水浴上挥至约2ml，放冷后，转移至5ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各iow，注入液相色谱仪，测定，得苦参碱和氧化苦参碱的含量之和为58.4wt%。实施例3苦参总碱凝胶的制备将卡波姆94010g加入550ml纯化水中，自然溶胀24小时，搅匀，放置备用。取苦参总碱40g加入乙醇200ml、丙二醇150g使溶解，将苦参总碱溶液加入备用溶液中，充分搅拌，使成凝胶状。最后补加纯化水至1000g，搅拌均匀、脱气、灌封、即得。实施例4苦参碱栓剂的制备取苦参碱25g，半合成脂肪酸125g，置8(TC水浴加热熔化，搅拌均匀，待温度降至约5(TC时注模，充分冷凝后，刮平取出，制成100粒。实施例5槐果碱软膏的制备取羊毛脂50g和凡士林946.5g加热熔化，搅拌，冷却至约60。C时，加入槐果碱3g，对羟基苯甲酸乙酯0.5g，不断搅拌至匀，冷凝，分装，即得。实施例6氧化槐果碱洗液的制备取氧化槐果碱5g，溶于适量蒸馏水中，加吐温-8020ml，加蒸馏水至10000ml，搅匀，分装成IOO瓶，灭菌，即得。实施例7氧化苦参碱胶囊的制备取氧化苦参碱50g，加过筛后的淀粉180g、硬脂酸镁20g混匀，喷乙醇适量，搅拌均匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。实施例8槐定碱片剂的制备取槐定碱50g，与过筛后的淀粉100g、微晶纤维素90g、硬脂酸镁10g混匀，喷乙醇适量，混匀，制粒，压成1000片，即得。实施例9苦参总碱注射剂的制备取苦参总碱500g，加注射用水9500ml，1,2-丙二醇100ml，氯化钠90g，用(UN的盐酸调pH值至6.0，加注射用水至10000ml，用0.2pm微孔滤膜过滤，灌封，装成1000瓶，湿热灭菌，即得。权利要求1、参中提取的生物碱作为活性成分在治疗支原体引起的疾病中的药物用途。2、苦参中提取的生物碱作为活性成分在治疗衣原体引起的疾病中的药物用途。3、苦参中提取的生物碱作为活性成分在治疗真菌引起的疾病中的药物用途。4、如权利要求1或2或3所述的苦参中提取的生物碱，其特征在于，是指苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱或苦参总碱。5、如权利要求4所述的苦参总碱，其特征在于，其中总生物碱含量为70.0wt%99.0wt%，苦参碱和氧化苦参碱的总量为45.0wt%90.0wt%。全文摘要本发明公开了苦参中提取的生物碱在治疗支原体、衣原体和真菌引起的疾病中的药物用途。所述的苦参中提取的生物碱是指苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱或苦参总碱，其中的苦参总碱中总生物碱含量为70.0wt％～99.0wt％，苦参碱和氧化苦参碱的含量为45.0wt％～90.0wt％。苦参中提取的生物碱作为活性成分制备的药物对支原体、衣原体和真菌均有良好的抑制作用，可用于治疗由支原体、衣原体和真菌感染引起的各类疾病。