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ReproRNA™-OKSGM为单链RNA复制子、非整合型的重编程载体。该载体包含一个嘌呤霉素抗性基因片段，用于筛选出含此载体的细胞。因此，没有含此载体的细胞会被嘌呤霉素去除。在转染后的第1到6天进行筛选，可去除培养中未被转染的成纤维细胞。STEMCELL Technologies推荐的筛选过程中嘌呤霉素的使用浓度为0.8 μg/mL。该浓度既保证嘌呤霉素的毒性足够去除未被转染的成纤维细胞以降低背景，又不会过量而对转染过的细胞具有毒性，导致重编程效率降低。对于一些特定的细胞系，如果在筛选步骤后发现剩余细胞或者被去除的细胞过少，说明0.8 μg/mL嘌呤霉素并不是一个合适的浓度。在此情况下，可按照以下步骤做一个细胞毒性检测来决定适当的浓度。 操作流程 1. 成纤维细胞以5 x 10^4 cells/mL的浓度接种于96孔板，并使用成纤维细胞培养基在 37°C，5%CO2条件下孵育过夜，使细胞贴壁。 成纤维细胞培养基: 高糖DMEM； 10% (v/v) FBS（胎牛血清）； 2. 第二天，制备含不同浓度嘌呤霉素的成纤维细胞培养基。请参见下面表格中的示例，您可根据需要来选取不同嘌呤霉素浓度或样本重复数。例如，选取嘌呤霉素浓度为1.2，1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1和0 μg/mL。 3. 在显微镜下观察96孔板，确认成纤维细胞已贴壁。通常情况下，细胞密度大约为80%。 4. 将原培养基换成含不同浓度嘌呤霉素的培养基，在37°C，5%CO2下培养过夜。 5. 在之后的5天内每天重复步骤2-4。请注意：需当天制备新鲜的含嘌呤霉素的培养基，我们不建议一次制备所需的全部培养基。 6. 在第5天，使用细胞活性检测（如MTT或LDH）得到能够去除80-100%的细胞的最小嘌呤霉素浓度。使用此浓度进行后续的ReproRNA™-OKSGM实验的筛选步骤。 示例：在96孔板中每个样本进行三次重复实验 答疑时间 Q：ReproRNA™工作流程是否是feeder-free和serum-free？ A：整个工作流程是feeder-free的，但在成纤维细胞培养期间我们建议使用10%的FBS。 Q：如果不小心将转染试剂和添加物放入了冰箱怎么办？ A：虽然转染试剂和添加物不应被冷藏保存，但可能依旧可以使用。您需要将试剂在室温解冻并观察是否有沉淀物出现，若有沉淀物出现应在室温继续解冻10-15分钟（期间可进行vortex确保沉淀物重新溶解）。一旦沉淀物溶解后，试剂和添加物即可使用。 Q：载体在细胞中会保留多久？ A：在B18R的作用下，载体会存在于细胞中。B18R可下调细胞对外源性RNA的先天反应。RNA中的非结构蛋白编码使得RNA可在阳性转染的细胞内复制。在嘌呤霉素的选择压力下，未能成功转染ReproRNA™的细胞无法存活。我们并未检测过诱导结束后ReproRNA™的残留情况。Yoshioka的文章检测了在去除嘌呤霉素和B18R蛋白后细胞内RNA的表达情况。他们观察到RNA在第8代（大部分在第5代）已全部被清除干净。另外，他们并未检测在细胞系中观测到任何的整合情况，提示使用本系统进行wild-type iPSC建立的安全性。而仙台病毒被证实在11代以后依旧存在于细胞中。 Q：重编程结束后，如何进行下游的分化？ A：使用ReproRNA™进行重编程的iPS细胞可成功的进行定型内胚层、外胚层和中胚层祖细胞的分化，具体的操作流程和推荐可点击这里申请我们的产品手册！ 操作视频
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