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慢病毒载体（LV）是基因和细胞治疗应用的关键工具。目前如何为临床应用提供足够数量的载体仍是一个难题，因此应促使该领域向更有利于大规模生产的悬浮培养发展。 此处我们描述了一种使用稳定的可诱导生产的细胞株来生产慢病毒载体的方法。所使用的HEK293细胞株可悬浮培养，具有直接的可扩展性，并在没有优化的条件下可产生106个转录单位(Tu)/mL带有绿色荧光蛋白(GFP)表达的慢病毒载体。此稳产细胞系被称为clone 92，是通过携带GFP编码基因的质粒稳转包装细胞系而得到的。此包装细胞系可通过cumate和多西环素的诱导表达慢病毒生产所需的必要组件。 首先，我们证明clone92可实现从20mL摇瓶至3L生物反应器的扩大生产。其次，我们开发了两种在1-3L生物反应器中使用超声细胞过滤技术的灌流模式，从而实现慢病毒载体的高产。第一种方法是使用基础培养液，并在诱导前和诱导后使用灌流模式以提高细胞密度和病毒回收。第二种方法使用强化培养液在批次模式下到达诱导所需的靶细胞密度，并在诱导后使用灌流模式。在灌流模式下，病毒滴度可达到3.2×107TU/mL。结果，与批次模式相比病毒总滴度增加了15倍，生物反应器累计产量达到8×1010TU/L。此灌流模式很适应大规模生产和商业制造。
慢病毒载体（LV）提供了许多有价值的特性，包括稳定的将基因整合到宿主基因组中，通过VSV-G假型分型将遗传信息转移到分裂和非分裂细胞以及广泛的组织趋向性能力。目前正在临床试验中用于治疗罕见和更频密的遗传和后天疾病，以及CAR-T细胞癌症治疗。 慢病毒载体通常是通过多质粒瞬时转染HEK 293贴壁细胞株而产生，此细胞株通常培养于含血清的培养液中。然而这种方法是实验室密集型，需依赖质粒的供应，不能直接放大。贴壁培养需通过增加细胞附着和生长的可用面积来放大。由于瞬时转染中过量的质粒和转染试剂的残留，会引起终产物的污染。因此，稳定的慢病毒载体生产细胞株运行而生。目前已成功的构建方法是通过诱导系统来避免细胞毒素蛋白（Gag，Rev和VSV-G）的持续表达而引起的细胞凋亡。用于稳定生产的贴壁细胞株已被广泛报道，但却限制了放大和大规模生产。通过高度强化的贴壁培养物，及一次性固定床生物反应器，已解决部分病毒放大培养。与此同时，一些学术和工业实验室正在开发悬浮培养工艺，最终可实现在传统的搅拌罐中完成慢病毒载体的生产。 根据近期文献报道，该领域正在向应用悬浮工艺生产慢病毒载体的方向发展。事实上，在治疗中应用的慢病毒载体，需要以可再生的方式生产足够数量的临床和商业品质的病毒。根据应用和疾病，每名患者需要1-40 × 10 9个感染单位的载体; 不仅增加了经济压力，还需要开发高产量的生产工艺。 在本研究中，我们提出了一种生产慢病毒载体的方案，它使用的是一种稳定的可诱导的生产细胞系，并且该细胞系为我们之前描述的并且在无血清培养基中悬浮生长的包装细胞系。在添加cumate和多西环素后，可诱导包装慢病毒载体所必需组件的基因表达。由于慢病毒载体的稳定性差，我们开发了一种在灌流模式下的生产工艺，并评估了两种方案的差异。 本研究所述的实验中，HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92细胞系（简称clone 92）生长和维持在SFM4TransFx293 (Hyclone)或者iHyCell™ TransFx-H media (Hyclone)培养液中，并且两种培养液均添加4mM L-谷氨酰胺。泊洛沙姆188是一种适用于高剪切力环境中的保护剂，并且在HyCell™ TransFx-H培养液中添加0.1%泊洛沙姆188。Cell Boost 5™（CB5）补充剂（3.5 g / L）（Hyclone）是一种化学成分的增强剂，只有在文中注明的情况下才补充。使用轨道摇床(InforsHT)，设置110-120 rpm，37℃，5%CO2条件下于摇瓶中悬浮培养。通过自动细胞计数器（Cedex Automated Cell Counter或Nucleocounter®nc-200™）或血球计数板和赤藓红B进行细胞计数。当细胞密度达到2×10 6个/ mL时，进行规律传代。 根据制造商建议，使用maxiprep试剂盒(Chiagen)纯化质粒。先前已经阐述通过一步法获得构建HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92所使用的包装细胞系（即，所有LV组分在一次转染中同时加入）14。为了构建clone 92，使用Lipofectamine 2000试剂（Life Technologies）与经StuI 线性化的pCSII-CMV5-GFP质粒和经Xho1线性化的编码杀稻瘟菌素的抗性的pCDNA6-hisA (Life Technologies) 质粒共同转染在补充有1％FBS（Hyclone）的LC-SFM培养液（Life Technologies）中培养的包装细胞系（clone 29-6），上述两种质粒质量比（μg/μg）为7：1。转染两天后，向培养液中加入7μg/ mL杀稻瘟菌素（InvivoGen），直至产生具有抗杀稻瘟菌素细胞库（约三周）。然后使用不含有杀稻瘟菌素的培养液在96孔板中有限稀释，并进行亚克隆。筛选克隆细胞并首次分析GFP的表达。将具有高水平GFP表达的克隆株扩增并通过加入1μg/ mL多西环素和30μg/ mL的cumate诱导细胞观测慢病毒的产生。从最稳定的生产克隆株中选取一株（clone 92），并在补充有4mM谷氨酰胺的SFM4Transfx-293无血清培养基（Hyclone）中适应性培养。研究细胞库在补充有10％DMSO（Sigma）的相同培养基中制备。 将clone 92在SFM4TransFx-293中解冻，并接种在含有20mL培养液的125mL摇瓶中。在解冻后2、6、10周时，在1×106个/mL细胞密度下诱导产生慢病毒载体。在48后，经离心澄清，收集含有慢病毒载体的上清液，并添加1%胎牛血清（保护剂），然后冻存在-80℃。采用基因转移法测定上清液中慢病毒载体滴度（2.6节）。 在第一组摇瓶实验中，细胞按0.2 x 106个/mL接种在SFM4TransFx293培养液中。当细胞密度达到1.5 x 106个/mL时，按照每瓶50mL分装于250mL摇瓶中。诱导前，需每天更换培养液，即细胞经离心（300g，5mins）后，更换不同比例（1-100%）的新鲜培养液进行重悬，且连续换液5天。为了减少细胞聚集，细胞经Accumax TM（Sigma）处理30分钟后，用Cedex自动细胞计数器进行细胞总数及活力的测定。 在第二组实验中，细胞按0.3×106个/mL密度分批次接种于500mL摇瓶中，培养液为100mL含有有3.5g/L CB5的HyCell™ TransFx-H完全培养液。当细胞密度到达≥5E6 个/mL时，将细胞悬液按每瓶20mL分装于125mL摇瓶中，并添加1μg/mL多西环素和30μg/ mL的cumate进行诱导。从诱导后24小时开始，每隔24小时，分别使用含有3.5 g/L CB5和不含CB5的的培养液进行50％换液。收集液经0.45μm过滤后，使用GTA测定病毒载体滴度。使用NucleoCounter®NC-200™记录每日细胞总数和活力。 使用生物反应器进行4次分批实验，同时灌流实验1#与先前实验条件相同；并且已经详细描述过相似情况。即使用Chemap 3.5L型SG生物反应器容器（工作体积2.7L）并配备探针以测量和控制实验参数（温度37℃，pH 7.05-7.1，溶解氧（DO）40％，搅拌80rpm）。在灌流模式中，通过反吹模式的10L超声滤器（AppliSens，Schiedam，Netherlands）将细胞保留在生物反应器中（每次反冲洗时将细胞悬浮液完全循环到生物反应器中），时间间隔为30分钟，运行/停止比例为55/5秒（图4）。培养物以分批模式培养至约1-1.5×106个/ mL。灌流模式以每天0.5反应体积实施灌流（VVD），并在诱导后增加至1VVD。当灌流模式中到达目标细胞密度（5×106个/mL）后进行诱导培养。 在灌流实验2-4#中，将细胞以0.25-0.35x106个/ mL的细胞密度接种到1L含有3.5g / L CB5的完全HyCell TM TransFx-H培养液（Hyclone）中，并在320F 1L搅拌罐反应器中批次培养（37℃，pH7.15，DO 40％和80RPM）。当细胞密度到达≥5×106 个/mL时，开始诱导。诱导后，用含有诱导剂的新鲜培养液开始灌流模式（1VVD）5-7天。在灌流过程中，使用miniBioSep（Applikon®）细胞保留（设置1 W功率）。通过NucleoCounter®NC-200™监测反应器每日细胞总数和活力。 在所有的灌流实验中，合并收获物并将含有慢病毒载体的上清液置于冰上或4℃直至澄清（每天一次），随后储存在-80℃直至GTA分析。由于在研究中使用了两种规格的生物反应器，因此每升培养液中病毒滴度的总量（TU/L）可进行直接比较。 已介绍过通过基于流式细胞术的基因转移分析技术（GTA）测定功能性病毒滴度（GTA滴度）的方法。即将HEK293A或293T细胞在含有5％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养液中培养。在用LV转导前5小时，将细胞以1E05个/孔的密度接种于24孔板上。在转导之前，将LV样品在补充有8g/ mL聚凝胺的DMEM培养液中连续稀释，并在37℃温育30分钟。移除培养液，并向细胞中加入200μL稀释后的LV样品，然后37℃培养过夜。第二天，每孔补加800μL培养液，再培养48小时后，使用流式细胞术定量表达GFP的细胞。因此，需在转导后第3天测量GFP。注意，由于在对照试验中，在转导10天后检测到相似的信号，因此在测量时需确定实验中测得的GFP信号是否真正由转基因表达，而不是附加体的存在(补充 Fig. 1)。滴度（TU / mL）使用公式[（GFP阳性细胞百分比/ 100）×（转导的细胞的数量）×（稀释倍数）×（1mL /转导体积）]。在所有测量中使用内部LV标准以使批间差异最小化。 此前已经介绍了一款包装细胞系，此细胞系除了病毒RNA外含有包装慢病毒的所有必需基因。此包装细胞系名为PacLV，是在单次转染操作中同时加入所有LV组分（Gag / Pol，Rev和VSV-G）。在包装细胞中，Rev和包膜蛋白（VSV-G）的转录处于四环素和cumate开关的控制下，这意味着需要在培养液中添加多四环素和cumate以诱导LV的产生（图1A）。而Gag/Pol 在CMV启动子控制下。即使Gag / Pol的表达是结构性的，并且不由开关直接控制，但其表达仍取决于REV响应元件（RERE Responsive Element，RRE）的存在。然后构建包含产生LV的所有元件（包括基因组RNA）的细胞系（称为生产者）。为了便于滴定测定，我们选择构建表达GFP的慢病毒载体，并且其由强组成型CMV启动子调控。可通过包含RRE的pCSII-CMV5-GFPq质粒共转染包装细胞系来实现。并且先前已经报道了关于质粒构建的细节。将生产细胞系命名为clone 92。为了验证clone 92生产慢病毒的稳定性，将细胞在摇瓶中培养10周，并在不同的时间点诱导，检测慢病毒的生产。整个过程中，慢病毒滴度均维持在3.0×106TU/mL以上，表明clone 92是稳定的（图1B）。 为了评估clone 92在搅拌式生物反应器中的性能，在SFM4TransFx293培养液（该细胞系的起始基础培养液）中以3.5L规模进行了4批培养（图2）。诱导3天（dpi）后，细胞活力均达到70-80%，具有可重复性降低（图2A）。慢病毒滴度生产动力学显示，均在3dpi出现峰值，平均滴度为6×106 TU / mL（图2B）。从摇瓶到分批模式的生物反应器培养，可实现的线性放大（图2C）。平均每升培养液的总LV产量为6×109TU，具体产量为4.4TU /细胞（图2D）。 为了解决慢病载体的低稳定性，我们安排在灌流模式下使用连续收获以实现慢病毒载体的快速生产。在预实验中，摸索了两种摇瓶实验方案。首先，确定在细胞生长期期间每日更换培养液（DMR）的作用，并考察诱导时高细胞密度对产量的影响。在-3dpi和0dpi之间，每天使用0-100％新鲜SFM4Transfx293培养液进行离心换液。结果表明，通过增加新鲜培养液的换液量可以延长细胞生长期；连续4天换液后，当0dpi时，细胞密度可达到8×106个/ mL，为批次对照的3倍（图3A）。诱导3天后，检测慢病载体含量，当新鲜培养液更换体积为75％-100％时，病毒滴度可从无培养液替换时的1.0×106 TU / mL增加至3.35×107 TU / mL，具有显著提高（图3B）。与100% DMR相比，75% DMR具有更高的产量。这表明在诱导条件下产生慢病毒载体的最佳细胞密度为通过75％DMR获得的约5.5×106个/ mL。 因此，在第二组小规模实验中，细胞密度定为5×106个/ mL。测试了在细胞生长阶段使用强化培养基和在生产阶段使用DMR的混合系统。选择使用一种不含水解产物并且具有较低批次间差异的新培养液（HyCell TM TransFx-H）。每天更换75％的培养液，并且当细胞密度达到5×106个/ mL时进行诱导，结果表明SFM4TransFx293和HyCell TM TransFx-H所得病毒滴度无差异（补充表1）。为了在分批模式下达到更高细胞密度，在HyCell TM TransFx-H培养液中补加Cell Boost（CB5），并且当细胞生长到5×106个/ mL时再进行诱导；在生产阶段期间，分别使用含有CB5及不含CB5的培养液每天更换50％(Fig. 3C)，结果表明，无论是否补加CB5均可在1dpi至3dpi得到相似的慢病毒滴度，但补充CB5却可提高4dpi和5dpi的滴度(Fig. 3D)。数据表明，诱导前在强化培养基（具有CB5的HyCell TM TransFx-H）中可获得与简化灌流生物反应器相似的细胞密度。另外，在生产阶段添加CB5可能会通过提高细胞活力以延长细胞生产期。 根据摇瓶实验结果，选择在进行生物反应器中灌流模式的参数。图4为用于灌流模式下操作的示意图。 第一组实验（Perfusion 1）作为参考使用SFM4TransFx293培养液在3.5L搅拌式生物反应器中进行生长和生产。每天0.5培养液体积开始灌流（VVD），并在诱导后增加至1体积。 为了简化流程，采用于摇瓶相似的混合模式实施另外三组实验（Perfusion2-4），并且在含有CB5的1L HyCell TM TransFx-H培养液中按分批模式扩增细胞。当细胞密度到达≥5×106个/mL时开始诱导，并用含有CB5和诱导剂的新鲜培养液按1VVD开始灌流。如图5A和5B所示，诱导后灌流实验1的细胞密度和活率与灌流实验2-4具有明显差异，并且与没有添加CB5的图2A、3A、3C相似，诱导后细胞活力迅速降低，在5dpi时细胞活力仅有25%并停止实验。相比之下，灌流实验2-4中并未停止产毒且在诱导后细胞扩增到17×106个/mL，直至最终收获时，存活率仍保持在80%以上（图5A-B）。在灌流实验1中，在3dpi出现到滴度峰值（2-3×107TU / mL），而对于灌流实验2-4，在4dpi出现峰值（图5C）。在4批次灌流实验中的总滴度均在5-8×1010TU/L范围内，且灌流实验1的总滴度最高（图5D）。在生物反应器中检测的滴度与收获容器相当（补充图2）。与分批培养相比，4次灌流实验测得的平均滴度（2.2×107TU / mL）比分批模式（6×106 TU / mL）高近4倍（图5 2B）。此外，由于每天收获，灌流模式的所得总载体（高达8×1010 TU / L）比批处理模式多11倍（图5B）。在分批模式中，诱导时的活细胞密度为1-1.5×106个/ mL，而灌流模式中为5.4×106个/ mL。与分批模式下的4.4.TU/细胞相比，灌流模式平均可达到11.5TU/细胞。 通过稳产细胞株(clone 92)，我们制定了两种在灌流高产实验方案。第一种方法使用基础培养液SFM4TransFx293和灌流模式来增加细胞密度和病毒载体回收（图3A-B和5A-B）。第二种方法中使用补加CB5的HyCell TM TransFx-H培养液：由于在诱导后才开始使用灌流模式，因此该方法可能简单更操作（图3C-D和5C-D）。总之，与分批模式相比，灌流模式可将病毒的总产量提高至15倍。尽管预期8×1010 TU / L的绝对病毒滴度是转基因依赖性的，但是我们推测与分批模式相比，超过1个对数的产量将可转移到其他转基因。 在已描述的稳产贴壁细胞系中，病毒滴度在1×106至1.5×108 范围内。 然而，贴壁细胞系在大规模生产中存在明显的局限性。本研究中，包装细胞系和稳产细胞系的母细胞系（HEK293SF3F6）已适应无血清悬浮培养28。使用双开关系统，即需要添加两种诱导剂才可启动病毒的合成，这是clone 92成功的一个关键因素，并且严格控制了慢病毒毒性因子的产生。在早期研究中，曾尝试过只使用一个开关，但未获得成功（结果未列出）。本研究中的生产细胞系可在悬浮状态下培养，但培养尚需进一步优化。 例如，添加CB5可将高病毒滴度（> 107TU / mL）时间延伸至超过4-5dpi，并且在诱导后可延缓细胞活力的下降，以维持细胞正常生长。CB5含有多种维持细胞活力的营养素，但某些组分（例如生长因子）可能对病毒产量产生反作用。实际上，在摇瓶实验诱导时间段，通过比较CB5的添加情况，可以得出在每个补加CB5的孔内，所得病毒滴度相当，且均低的多（图3C，D）。设想可通过平衡病毒生产（细胞毒素过程）与细胞状态以开发一种连续的生产模式。 相反，在未添加CB5的SFM4TransFx293基础培养液中，截止3dpi病毒均可被快速释放（图4C和D）。在生长阶段补加CB5并在生产阶段去除CB5可能进一步提高早期的产量。全面的代谢物分析以及CB5成分更详细的分析也是有意义的，并支持在更高细胞密度下的诱导。 纯化和下游加工同样影响终产品的滴度。有研究表明，目前正在研究通过柱/膜色谱法以减少终产品中杂质的含量。虽然Cumate具有非细胞毒性，但多西环素是四环素类抗生素，因此纯化过程中还应去除本研究添加的两种诱导剂。即使终产品中只存有痕迹，但对于患有四环素过敏的人来说将会是一个大问题。 总之，据我们所知，本研究是第一个描述慢病毒载体稳产HEK293悬浮细胞系的工艺开发和改进。从小规模到1~3L级生物反应器具有良好的重现性和稳定性。本与研究评价了两种改善慢病毒载体总产量的方案，且这两种方案均在灌流模式下采用了超声波细胞过滤技术。总的来说，实现了总病毒滴度（TU/L每升培养液）超过1个对数的增加。这意味着我们能够在灌流模式下生产高达8 x 1010 TU / L的载体。预计所开发的生产工艺很适合大规模生产和商业化制造。
补充表1：在两种不同的培养基中病毒滴度结果。每日更换75%培养液，当细胞密度约为5×106个/ mL时开始诱导细胞，并通过GTA在3dpi测量滴度。 补充图1： 在转导后3天和10天分别进行GFP表达定量。 两个时间点之间没有显着差异。 误差线为对应3种不同稀释度的每个样品3次测量的标准偏差。
Manceur AP, Kim H, Misic V, et，al.Scalable Lentiviral Vector Production Using Stable HEK293SF Producer Cell Lines.Hum Gene Ther Methods. 2017 Dec;28(6):330-339. doi: 10.1089/hgtb.2017.086. Epub 2017 Nov 21. 会议推荐 |
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