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本人科研狗一枚，初升研二的时候，当得知自己要带学妹了，内心无比激动，感觉人生到达了巅峰，内心OS：一定要让学妹崇拜上我这个风流倜傥的师兄，然而做上实验才发现，真的是心有余而力不足。 首先，我很受不了事先不做功课，完全等别人教的态度，如果别人跟我说，第二天要教我做什么实验，我一定会前一天做好笔记，熟悉过程，最起码不能上来的时候一脸蒙蔽的状态吧。 不过，怕什么来什么，我就是碰到了这样的师妹。进实验室不久，我就开始教她们最基础的实验——Western blot，在我口述了两遍实验过程，注意事项，每一步的意义以及手把手教学后，以下是她们犯过的错误： 1、 组织研磨时不用力：我们用研磨棒研磨组织，提取组织蛋白时，一定要用力，组织研磨的越充分，提取蛋白的量与效果越好，如果有电动研磨器当然会事半功倍，但是需要手动时，就必须用力研磨至少30min,即便如此，离心后的组织蛋白仍会有较多沉淀，然而我的师妹用一种搅拌奶茶的力度研磨组织。。。。。。 2、 组织研磨时没有在冰上进行：提取蛋白的全程要在冰上进行，以防蛋白降解，然而我的师妹，别说冰了，连水都没给我。。。。。。 3、没有蛋白定量：提取蛋白后，直接加Loadingbuffer煮沸，没有测浓度，第一步就夭折了。更气的是，师妹说，要不看看之前都加多少。。。。。蛋白定量是必须的，不然后续的数据分析就毫无意义，蛋白定量有时会存在误差，我们可以根据内参的灰度分析适当调整，但是定量是一定要有的。 4、不清楚分离胶和浓缩胶的意义：师妹第一次灌胶，先制备浓缩胶，后制备分离胶，看的我一脸懵逼，都不知道她在做啥子。做实验的时候脑子一定要清楚每一步在做什么，简单点说，浓缩胶的孔径较大，就是将所有蛋白压缩到同一起跑线，以便后续分离。而分离胶的作用，根据不同的浓度分离不同分子量大小的蛋白，浓度越高，孔径越小，适合分离小分子量蛋白。 5、漏胶：玻璃板对齐，心平气和，即使老手，也有漏胶的时候。 6、电泳时电压错误：一般情况下，80V,300mA跑浓缩胶，120V,300mA跑分离胶，具体电压和时间可能会根据不同的蛋白和机器略作修改，但是你用220V给我跑，是要着急投胎吗？ 7、转膜时用用乙醇浸泡PVDF膜：甲醇浸泡PVDF膜是为了激活膜上带有的正电荷，便于与蛋白负电荷相结合，乙醇泡是什么鬼。 8、转膜时，分离胶和PVDF膜的位置放反：正规操作是黑板放胶，红板放膜。反着操作的话，肯定是竹篮打水一场空了。 9、转膜时没有将转膜仪置于冰水混合物中：转膜时因为电压高，所以机器温度会远高于电泳时的温度，没放在低温下转膜的结果就是，你连内参都看不到。 10、PVDF膜是有正反面的：跑完的分离胶没有正反面，但是转膜之后的PVDF膜是有正反面的，与分离胶紧贴的一面才是蛋白转印上去的一面，要做好标记，以免弄错。 以上是我总结的科研新手在做Western blot时可能会犯的错误（确实包含吐槽情绪），咋说呢，都不是难题，大部分情况都是由于马虎不细心，虽然我内心吐槽无数遍，但还是把自己的笔记本默默交给了学妹，研究生的学习生活不会像本科那样，教学很少，主要靠自学和领悟，将被动学习转换成主动学习，才是研究生该有的态度。 PS：今天就策到这里，过年了，希望大家都有对象牵回家。 |
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