柠檬苦素治疗肺癌

​原发性支气管肺癌(简称肺癌)是危害人类健康的主要疾病之一，肺癌的发病率近年来在我国呈上升趋势，在确诊时约87%的患者已属晚期，多数患者发现时已失去手术机会或不愿手术，因此治疗较为局限且疗效较差。尽管新药(吉西他滨、紫杉类、长春瑞滨)和铂类联合组成的第三代化疗方案疗效有一定提高，但患者的生存率仍然有限，化疗虽然在杀灭、缩小肿瘤方面具有一定的作用，但也存在损伤人体正常功能、疗效不确定等弊端。中医药及中西医结合治疗肺癌，趋向于辨证与辨病结合，扶正与祛邪结合，改善症状，提高生存质量，稳定病灶，延长生存期和提高生存率，并可以配合手术、放化疗减少毒副反应和提高临床疗效。世界各国对肺癌的治疗工作极为重视，随着20世纪科学技术的快速发展，防治肺癌的研究工作取得了很大进展。从总体观察，治疗肺癌单纯依靠手术切除、放射线等治疗已感不足，特别是对中晚期肺癌的治疗很难奏效。

中医认为，肺癌属“肺积”、“咳嗽”、“咳血”、“胸痛”的范畴。主要形成原因是正气虚损，阴阳失调，六淫之邪乘机而侵入犯肺，肺气阻滞，宣降失司，气机不畅，血行受阻，水液运行障碍，津聚为痰，痰凝气滞，气滞血瘀，痰气瘀毒，邪积胸中，遂结成有形积块。本病病位主要在肺，与脾、肾等脏腑关系密切。总属于本虚标实，正气虚弱为本，痰瘀互结为标，故扶正补虚是其总的治疗原则，辅以袪痰，化瘀，行气等去其标。

目前肺癌疾病急需有效的治疗药物。

小黄皮叶：为芸香科小黄皮（Clausena emarginata Huang）的叶。性味：苦、辛，微温。有毒。功能主治宣肺止咳，行气止痛，通经活络。主治感冒头痛，风寒咳嗽，偏头痛，胃痛，神经痛，牙痛，风湿关节炎，跌打损伤。

香椿叶：楝科椿属植物香椿Toona sinensis （A. Juss.） Roem.，[Cedrelasinensis A. Juss.]的叶。夏秋采叶。收载于《全国中草药汇编》。性味苦、涩，温。功能主治祛风利湿，止血止痛。叶及嫩枝：痢疾。香椿根皮：用于痢疾，肠炎，泌尿道感染，便血，血崩，白带，风湿腰腿痛。香椿果：胃、十二指肠溃疡，慢性胃炎。

迄今为止，尚未见小黄皮叶及香椿叶配方中柠檬苦素类提取物的制备相关文献或专利等报道。

发明内容

本发明的目的在于提供小黄皮叶及香椿叶中柠檬苦素类提取物的一种制备方法及新用途。本发明所提供的小黄皮叶及香椿叶中柠檬苦素类提取物的一种新用途是在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所用小黄皮叶为芸香科小黄皮（Clausena emarginata Huang）的叶，香椿叶为楝科椿属植物香椿Toona sinensis （A. Juss.）Roem.，[Cedrela sinensis A. Juss.]的叶。

柠檬苦素类提取物的制备方法，是通过如下步骤实现的:

（1）取小黄皮叶3重量份、香椿叶1重量份，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，50℃提取2次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；

（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，70℃提取3次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的10倍，滤过，合并乙酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；

（3）将步骤（2）乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比3:7的水-乙醇混合溶剂提取，80℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的15倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；

（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，90℃提取2次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的8倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；

（5）将步骤（1）得到的粗提物A，经过重量份数比1:8混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比100:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为16个色谱柱体积，收集体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；

（6）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比1:6混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比10:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为12个色谱柱体积，收集体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；

（7）按重量比4:3将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。

本技术方案的柠檬苦素类提取物同时含有：山楝素A、山楝素C、老虎楝素C，且山楝素A、山楝素C、老虎楝素C的重量比例为3:2:1。

本技术方案的柠檬苦素类提取物可用于制备治疗肺癌药物，治疗肺癌有效。

一种柠檬苦素类提取物的制备方法，还可以通过如下步骤实现:

（1）取小黄皮叶3重量份、香椿叶1重量份，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，50℃提取2次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；

（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，70℃提取3次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的10倍，滤过，合并乙酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；

（3）将步骤（2）乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比3:7的水-乙醇混合溶剂提取，80℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的15倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；

（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，90℃提取2次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的8倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；

（5）将步骤（1）得到的粗提物A，经过重量份数比1:8混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比100:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为16个色谱柱体积，收集体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；

（6）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比1:6混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比10:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为12个色谱柱体积，收集体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；（7）按重量比0.5:0.2:4:3将步骤（3）得到的粗提物C、步骤（4）得到的粗提物D、步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。

本技术方案首次对小黄皮叶及香椿叶配方中柠檬苦素类提取物提取制备，采用MCI 凝胶-硅胶混合色谱柱的方法，制备得到同时含有山楝素A、山楝素C、老虎楝素C的重量比例为3:2:1的柠檬苦素类提取物，治疗肺癌疗效显著。

具体实施方式

下面通过具体实验例和实施例对小黄皮叶及香椿叶中柠檬苦素类提取物的制备方法做进一步说明，但不限于本发明。

实施例1：柠檬苦素类提取物的制备

（1）取小黄皮叶3kg、香椿叶1kg，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，50℃提取2次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；

（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，70℃提取3次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的10倍，滤过，合并乙酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；

（3）将步骤（2）乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比3:7的水-乙醇混合溶剂提取，80℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的15倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；

（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，90℃提取2次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的8倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；

（5）将步骤（1）得到的粗提物A，经过重量份数比1:8混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比100:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为16个色谱柱体积，收集体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；

（6）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比1:6混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比10:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为12个色谱柱体积，收集体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；

（7）按重量比4:3将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。

实施例2：柠檬苦素类提取物的制备

（1）取小黄皮叶3重量份、香椿叶1重量份，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，50℃提取2次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；

（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，70℃提取3次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的10倍，滤过，合并乙酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；

（3）将步骤（2）乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比3:7的水-乙醇混合溶剂提取，80℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的15倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；

（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，90℃提取2次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的8倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；

（5）将步骤（1）得到的粗提物A，经过重量份数比1:8混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比100:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为16个色谱柱体积，收集体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；

（6）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比1:6混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比10:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为12个色谱柱体积，收集体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；

（7）按重量比0.5:0.2:4:3将步骤（3）得到的粗提物C、步骤（4）得到的粗提物D、步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。

实施例3：柠檬苦素类提取物的制备

（1）取小黄皮叶3重量份、香椿叶1重量份，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，50℃提取2次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；

（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，70℃提取3次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的10倍，滤过，合并乙酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；

（3）将步骤（2）乙酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比3:7的水-乙醇混合溶剂提取，80℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的15倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；

（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，90℃提取2次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为小黄皮叶及香椿叶总重量的8倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；

（5）将步骤（1）得到的粗提物A，经过重量份数比1:8混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比100:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为16个色谱柱体积，收集体积比10:20的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；

（6）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比1:6混合均匀的MCI 凝胶-200目硅胶混合色谱柱，先以体积比10:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，再用体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱，洗脱量为12个色谱柱体积，收集体积比1:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；

（7）按重量比1:1:1:1将步骤（3）得到的粗提物C、步骤（4）得到的粗提物D、步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。

实验例1：总柠檬素含量测定。

采用高效液相色谱－蒸发光散射方法，分析柠檬苦素类提取物中柠檬苦素类成分的含量。采用YMC-Pack C18( 150 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，以流动相甲醇-水-四氢呋喃( 60:36:4) 进行洗脱，流速 1.0mL/min，柱温25℃；采用蒸发光散射检测器，漂移管温度92.0℃，载气流速2.0L/min。结果表明，实施例1提取物所得柠檬苦素类成分含量占总提取物的81%，且山楝素A、山楝素C、老虎楝素C的重量比例为3:2:1。

表1 提取物中柠檬苦素类成分及含量

实验例2：柠檬苦素类成分结构鉴定

按实施例1方法制备柠檬苦素类提取物，再经200-300目硅胶柱层析，先以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.1-10:30），再用乙酸乙酯-甲醇（10:0.5-3:1）梯度洗脱，薄层跟踪检测，合并相同流份，分别得到化合物1、化合物2、化合物3，其中化合物1、化合物2均为无色油状物，化合物3为白色无定形粉末，以上各化合物的化学结构经质谱和核磁共振等波谱手段确证为：山楝素A（aphanamixin A）、山楝素C（aphanamixin C）、老虎楝素C（trichiconinC），纯度经高效液相色谱检测均大于98%。

实验例3：柠檬苦素类提取物HPLC-MS分析

样品溶液制备：实施例1柠檬苦素类提取物，用甲醇制备供试品溶液，用0.45um有机微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

标准品溶液的制备：取自制的山楝素A、山楝素C、老虎楝素C，加甲醇适量，作为标准品溶液。

仪器：德国Thermo Fischer Scientific高分辨液相色谱质谱联用仪。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱（5μm，250mm*4.6mm），柱温：25℃，流速800μl/min，检测波长：550nm，进样体积：5ul。流动相：以乙腈为流动性A，以0.1%氨水为流动性B，进行梯度洗脱；

质谱条件：LTQ-Orbitrap XL型质谱，ESI离子源，鞘气50arb，毛细管温度275℃，辅助气10arb，毛细管电压25V，喷雾电压4.0kV。正离子模式扫描，m/z扫描范围100~1000。

结果：标准品和样品一级，二级总离子流分别吻合，结合一级，二级质谱，分子离子峰及碎片峰，鉴定出总柠檬苦素类提取物含有山楝素A、山楝素C、老虎楝素C共3个主要柠檬苦素类化合物。

实验例4：治疗肺癌的试验研究

1 材料

1.1 治疗药物

实施例1柠檬苦素类提取物、实施例2柠檬苦素类提取物、实施例3柠檬苦素类提取物、实施例1粗提物A、实施例1粗提物B、实施例1粗提物C、实施例1粗提物D、实施例1提取物E、实施例1提取物F。

1.2 阳性对照药物

金喜素(注射用盐酸托泊替康)，贵州汉方制药有限公司，批准文号:国药准字H20000428，规格: 2mg/瓶。

1.3 人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞株

人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞株购买于南京凯基生物科技发展有限公司，

培养要求:贴壁培养:

培养基:RPMI-1640+10%小牛血清+1%双抗

消化液: 0.25%胰蛋白酶

冻存液:胎牛血清:DMSO=9:1

培养条件:二氧化碳培养箱: 5%CO2， 37℃。

2 方法

2.1 给药方法

2.1.1 药物配置成浓度适宜浓度的溶液，再经过高压消毒锅灭菌，4℃冰箱存放备用。

2.1.2 金喜素(注射用盐酸托泊替康)人体每日用量:1.2mg/m2。

2.2 人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞的培养

2.2.1 细胞鉴定

对收到的细胞株进行鉴定，由专职病理老师在倒置显微镜下观察鉴定，并结合南京凯基生物科技发展有限公司提供的细胞资料，鉴定为NCI-H446细胞株。

细胞株收到后，细胞培养瓶完好无损，培养液无外渗，培养液无混浊。在倒置显微镜下观察细胞密度，汇合度约为60%，未达到细胞传代要求的汇合度80%的要求，将培养瓶中培养液吸出，留10 ml培养液继续培养，细胞形态呈现圆形或梭性。过了2d后细胞汇合度超过80%后，按细胞传代要求进行传代。细胞高度恶性，未分化。癌细胞体积小，核圆形和卵圆形，癌细胞胞浆少，核浆比例明显增大，核外形不规则，核分裂多见，癌细胞界限不清。

2.2.2 细胞传代

继续培养细胞，直到细胞汇合度达到细胞传代为80%的要求时，进行细胞传代。在NCI-H446细胞瓶内加入0.25%胰蛋白酶，消化3-6min，加入培养基吹打，制作成细胞悬液按1：2传代。

按细胞培养条件进行传代，经过3次传代培养后，细胞一共有8瓶。细胞形态呈现圆形或梭性，将其中4瓶冻存。将2瓶用于后续实验，另外2瓶继续传代培养。

2.3 细胞生长曲线绘制

2.3.1 细胞加样 计算细胞浓度2次，得出细胞浓度平均值。然后将细胞悬液等量的加入培养板的每个孔中，每天观察4个孔，培养时间计为7d。

2.3.2 观察指标 每隔24h吸去4个孔的培养液，加入消化液，混悬细胞，计数细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞浓度平均值。

2.3.3 绘制细胞生长曲线 横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度，绘制细胞生长曲线。细胞倍增时间约为26h。

2.4 细胞增殖抑制实验

2.4.1 细胞加样 取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液加入细胞计数板进行计数，配制为5000个/ml细胞浓度，将其接种细胞培养板。96孔细胞培养板每孔100μl放入37℃， 5%CO2培养箱继续培养。

2.4.2 加药方法 细胞加样后经过24 h培养，从二氧化碳培养箱中取出96孔细胞培养板，在通过倒置显微镜观察细胞形态，确定细胞生长良好后，按实验分组用取样器每孔加入相应液体各5μl。每组4个复孔。

2.4.3 检测方法 再经过24 h培养后，在96孔细胞培养板中加入MTT溶液10μl继续培养4 h。吸去培养液，加入与培养液相同量的DMSO。然后振荡10min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定光吸收值。

2.4.4 实验分组 根据药物细胞毒实验求出的药物IC50值，得出药物的IC50值所在的给药浓度范围。本实验IC50值所在的给药浓度范围在1-100μg/ml之间。因此实验分组如下:

药物组:取柠檬苦素提取物组的中间浓度(50μg/ml)；

药物加西药组:取柠檬苦素提取物组的中间浓度(50μg/ml)并加用西药；

西药组；

空白对照组(只加细胞培养液)，共4个大组，每一组各4个复孔。

2.4.5 观察指标 在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm，测定OD数值。并进行形态学观察。

2.4.6 绘制细胞增殖抑制实验图 表细胞存活率(%)=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%，对照组为只加等量的细胞培养液而不加任何药物。细胞增殖抑制率(%)=(1-细胞存活率)×100%。以时间为横轴，以细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞增殖抑制实验图表。

2.5 实验条件 控制全部实验在遵义医学院中心实验室完成，细胞培养及相关检测在其细胞培养室完成。

2.6 统计学处理方法 方差分析两两差异比较用LSD-t检验，两者间比较用均数比较。统计学软件应用MicrosoftExcel2000进行统计分析。

3 结果

3.1 不同浓度实施例1柠檬苦素类提取物对NCI-H446细胞的增殖抑制作用

人小细胞肺癌NCI-H446细胞在10， 25， 50， 75， 100μg/ml的5个浓度上，癌细胞呈现出相应的变化:即随着实施例1柠檬苦素类提取物浓度的增高癌细胞数量明显减少。NCI-H446细胞在低浓度25μg/ml时，细胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态。NCI-H446细胞在较高浓度75μg/ml时，癌细胞呈卵圆形，梭形；核大、胞浆少；核仁不明显，核分裂不明显。NCI-H446细胞在较高浓度100μg/ml时，细胞数量继续减少，癌细胞呈结构不清。

3.2 同浓度柠檬苦素类提取物对NCI-H446细胞的增殖抑制率

各柠檬苦素类提取物在10， 25， 50， 75， 100μg/ml各浓度和在24，48，72h这3个观测时间点与空白组(培养基对照组)比较均有统计学差异。结果显示不同浓度柠檬苦素类提取物作用48h对NCI-H446细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着作用时间的延长抑制作用逐渐减弱，且随着给药剂量的增大，抑制作用增强。

3.3 细胞形态学观察

各柠檬苦素类提取物组选用的中间浓度(50μg/ml)。人小细胞肺癌NCI-H446细胞在4种不同给药方式作用下呈现不同细胞形态。其中柠檬苦素提取物加西药组在48h观察点上效果最明显，细胞核完全固缩，核溶解，细胞轮廓难以辨认；其次是西药组，细胞呈现出细胞核固缩，核溶解，细胞轮廓勉强可以辨认；再次是柠檬苦素提取物组，细胞呈现出偶尔有细胞核固缩，细胞轮廓清楚，细胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态，癌细胞呈卵圆形，梭形但不规整；空白出细胞存活状态良好，核大、胞浆少；核仁不明显，核分裂活跃，只是偶尔有衰老细胞增多。

3.4对NCI-H446细胞的增殖抑制率

结果表明，柠檬苦素提取物在体外对人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞具有抑制作用，具有潜在药用价值，值得进一步深入研究。