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作者：卢 涛，王 帅，蒋 伟 单位：复旦大学附属中山医院胸外科 小分子双链RNA（dsRNA）是以目的基因启动子为靶点设计的互补RNA。dsRNA具有高度特异性、高效性和低毒性。LI等将这种dsRNA导入人肿瘤细胞后发现，其能够上调目的基因的表达。因此，将这种新的基因调控机制称为RNA激活（RNAa），并且将能够激活目的基因表达的小分子称为小激活RNA（saRNA）。
saRNA是针对特定靶基因序列人工合成的长度为21 nt的dsRNA。RNA激活效应的特异性与dsRNA的长度密切相关，这种性质决定了saRNA的激活作用具有细胞特异性及序列特异性。saRNA通常用转染的手段导入细胞，特异性结合靶向基因的启动子区域，在转录水平实现目的基因的表达激活，进而在基因水平达到治疗疾病的目的。
目前，saRNA的主要研究方向为激活肿瘤相关基因，主要为上调抑制细胞增殖、分化、转移和侵袭的基因表达，进而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。saRNA可上调特异性抑癌基因的表达水平，从而抑制肿瘤细胞的恶性行为（表1）。本文对saRNA介导的抑癌基因表达激活及其在肿瘤治疗方面的应用进行综述。  1 saRNA的分子机制及设计原则 saRNA作用于基因调控序列的特异位点，诱导基因转录，这已经得到学者们的普遍认同，并成为新的肿瘤研究热点。然而，RNAa的细胞分子机制目前尚不完全明确。saRNA一般是21 nt的外源性短双链RNA。导入细胞质的saRNA与Ago-2（Argonaute-2）蛋白形成saRNA-Ago-2复合物。Ago-2为saRNA-Ago-2复合物的形成提供平台，并引导复合物进入细胞核。saRNA-Ago-2复合物在细胞质中形成，但其进入细胞核的机制仍不清楚。进入细胞核的saRNA-Ago-2复合物在引导链的指引下靶向结合于DNA启动子序列的特异位点，并通过组蛋白修饰酶改变局部空间构象及组蛋白乙酰化状态，从而上调目的基因表达[1-3,30]。研究表明，saRNA诱导的基因激活可能受DNA超甲基化的影响，所以应避免saRNA靶序列中存在CpG岛。然而，DNA超甲基化对RNAa的抑制作用是否具有普遍性或基因特异性仍不明确。RNAa诱导的基因表达上调需在saRNA转染24～48 h后才能检测到，在4～5 d后达到高峰，并持续10 d以上。由此说明，RNAa具有独特的动力学特征。目前，对于saRNA作用的具体分子机制仍需要进一步研究。
RNAa涉及复杂的分子调节机制，可能影响RNAa效率的表观遗传因素尚不明确。因此，目前对于saRNA并无规范的设计方法。综合分析前期实验和文献报道，总结saRNA的设计原则如下：（1）目标靶点选择在DNA正义链序列上；（2）与DNA正义链互补的RNA链作为导链，DNA链的3’端与RNA链的5’端相对应；（3）saRNA靶点选取在转录起始点上游200～1 200 bp；（4）saRNA长度为21 bp，在saRNA 3’端外挂dTdT或者UU；（5）GC含量为40%～65%；（6）靶片段中避免出现4个连续相同的碱基；（7）3’端的热力学稳定性低于5’端；（8）第19个碱基为“A”；（9）第18个碱基为“A”或者“T”，“A”更优；（10）第7个碱基为“T”较佳；（11）第20～23个碱基（即靶片段3’端）为“A”或者“T”；（12）避免出现易受DNA甲基化影响的位点，如CpG岛、CpG位点和GC富集区域等。目前，筛选合适的saRNA靶位点比较困难，通常需要设计多个saRNA分子用于筛选。saRNA设计及筛选方法仍需要进一步优化，以提高RNAa的效率。 2 saRNA在肿瘤治疗中的应用 2.1saRNA与p21
p21WAF1/CIPI是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，参与细胞周期的调节。p 21WAF1/CIPI基因突变或缺失与多种恶性肿瘤的行为有关。因此，通过调节p21WAF1/CIPI的表达进而影响肿瘤细胞的生物学行为在理论上具有可行性。YANG等发现，p21-saRNA可上调膀胱癌T24细胞内p21的表达水平，抑制膀胱癌细胞的增殖和活力，并且具有剂量和时间依赖性。进一步的分子机制研究表明，p21-saRNA上调p21表达后，可下调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达，上调凋亡相关蛋白caspase-3和多聚核糖核酸聚合酶（PARP）的表达。KANG等将氟修饰的p21-saRNA（p21-saRNA-F）结合脂质纳米颗粒（LNP），研究p21-saRNA应用于膀胱癌治疗的潜在可行性。通过膀胱内给药，将LNP p21-saRNA-F注入原位人膀胱癌的小鼠模型，发现LNP p21-saRNA-F可被小鼠膀胱尿路上皮摄取，并且显著上调小鼠原位膀胱癌组织内p21的表达。动物实验表明，LNP p21-saRNA-F治疗可促进体内p21活化，使40%的小鼠肿瘤缩小或消失，显著延长原位膀胱癌小鼠的生存期。WANG等[4]证实，p21-saRNA可上调结直肠癌HT-29细胞中p21 mRNA和蛋白的表达水平。经p21-saRNA处理后，HT-29细胞的增殖能力下降，集落形成减少，细胞衰老加速。动物研究表明，p21-saRNA上调结直肠癌HT-29裸鼠移植瘤组织内p21的表达，显著抑制小鼠体内移植瘤的生长。研究发现，肝癌细胞HepG2、Hep3B和SMMC-7721经p21-saRNA转染后，细胞中p21 mRNA和蛋白的表达水平显著上调；p21-saRNA转染HepG2、Hep3B和SMMC-7721细胞48 h后，细胞的增殖和迁移能力均显著下降。这一结果表明，p21-saRNA能抑制肝癌细胞的生长和侵袭。KOSAKA等将p21-saRNA转染至肝癌HepG2和Hep3B细胞中，发现p21-saRNA可阻滞细胞周期进程和诱导细胞凋亡，在体外发挥抑制肝癌细胞增殖的作用。对肾癌ACHN细胞和膀胱癌5637细胞的研究发现，外源合成的p21-saRNA能激活细胞中p 21基因的表达，且该激活效应不受p53蛋白表达水平的影响。saRNA可以特异性上调p21的表达，并且与诱导肿瘤细胞G0/G1期细胞周期停滞和凋亡有关。因此，通过saRNA上调p21的表达可能成为治疗人类膀胱癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌和肾癌的一条途径，特异性激活p21的RNAa技术为治疗肿瘤提供了新的思路。
2.2saRNA与p53
p 53是细胞内最重要的抑癌基因之一。p53激活可诱导细胞生长停止或细胞凋亡，在体内不仅可防止肿瘤细胞出现，而且可以清除已存在的肿瘤细胞。研究表明，肿瘤细胞均表现出不同程度的p53功能失活，一部分肿瘤细胞出现p53翻译后修饰缺陷，或者完全抑制p53的表达；另一部分肿瘤细胞则表达变异型p53。p53失活对细胞癌变的发生和发展有着重要作用。因此，在肿瘤细胞中恢复p53的活性和激活其表达已成为当前抗肿瘤研究的热点。目前，主要利用病毒载体转染实现在肿瘤细胞中恢复p53的功能，但是这种方法受基因传递效率和病毒传递相关副作用所限。因此，简洁高效的saRNA激活p53的抗肿瘤途径可能成为新的研究方向。
WANG等将p53-saRNA转染至人膀胱癌T24和EJ细胞，结果发现p53-saRNA可显著抑制细胞增殖和克隆形成，诱导细胞G0/G1期停滞，进而抑制细胞迁移和侵袭。动物实验也证明，p53-saRNA可显著抑制荷膀胱癌裸鼠肿瘤的生长和转移。这一结果表明，p53-saRNA可以在体内外抑制肿瘤细胞的增殖和转移。GE等将p53-saRNA转染至人前列腺癌LNCaP和DU145细胞后，发现细胞中p53 mRNA和蛋白的表达水平显著上调。此外，p53-saRNA可促进野生型p 53的过表达，下调cyclin D1和细胞周期蛋白依赖性激酶4/6的表达，从而将前列腺癌细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖和克隆形成。以上研究表明，saRNA可特异性上调肿瘤细胞内抑癌基因p 53的表达，发挥有效的抗肿瘤作用。
2.3saRNA与E-cadherin
E-cadherin是一种上皮黏附分子，在上皮细胞与细胞黏附中发挥关键作用，维持组织结构的稳定性。E-cadherin被认为是一种抑癌基因，并与肿瘤侵袭、转移及预后相关。E-cadherin基因突变或表达缺失可导致肿瘤迁移与侵袭能力增强，对肿瘤进展起着重要的作用。有研究表明，E-cadherin基因的再表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。
WU等合成的E-cadherin-saRNA可通过靶向基因启动子中的非编码调节区而上调E-cadherin表达，揭示saRNA对E-cadherin表达的调控作用。MAO等发现，saRNA可以上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平，从而在体外抑制人膀胱癌5637细胞和前列腺癌PC3细胞的迁移和侵袭。这种抑制作用与β-连环蛋白从细胞核重新定位到细胞质膜，并降低β-连环蛋白介导的反式激活有关。JUNXIA等[23]利用RNAa技术激活乳腺癌细胞中E-cadherin的表达，证明E-cadherin高表达可导致乳腺癌细胞发生凋亡，抑制细胞的增殖和迁移。动物实验的结果也显示，saRNA可以在体内抑制肿瘤生长。这些研究表明，saRNA可增强抑癌基因E-cadherin的表达，为治疗膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌等提供了一种新的策略。
2.4 saRNA与CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPα）
CEBPα基因编码的C/EBPα蛋白是碱性亮氨酸拉链类转录因子，是一种肿瘤抑制因子，其作用机制可能为通过激活p21和抑制细胞周期蛋白依赖性激酶而导致有丝分裂停滞。所以，利用saRNA激活CEBPα通路表达具有抑制肿瘤生长的潜力。
VOUTILA等研究发现，CEBPα-saRNA可使人肝细胞癌细胞中C/EBPαmRNA的表达水平上调2.5倍。这种上调是一种转录驱动过程。CEBPα的激活上调不仅可以抑制肿瘤细胞的生长，而且还可以恢复晚期肝癌患者的肝功能。通过对大鼠肝癌模型的研究证明，CEBPα-saRNA可导致肿瘤体积减小，血清白蛋白水平上升，胆红素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平降低。YOON等将C/EBPα-saRNA与胰腺导管腺癌特异性2’-氟嘧啶RNA适配体P19和P1连接，构建特异性转运载体。P19和P1-CEBPα-saRNA共轭体可上调CEBPα的表达水平，进而显著抑制细胞增殖。在小鼠胰腺癌模型中发现，saRNA/配体结合物可导致肿瘤体积减小约40%，并且没有显著的生物学毒性。以上实验证明，CEBPα-saRNA可特异性上调C/EBPα的表达，抑制胰腺癌细胞的恶性生物学行为，可以作为潜在的胰腺癌靶向治疗方案。
2.5 saRNA与其他基因
saRNA还可上调多种基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移等作用。二氢嘧啶酶样3（DPYSL3）在前列腺癌中被确定为转移性抑制因子。saRNA可增强DPYSL3转录变体2（DPYSL3 variant 2，DPYSL3v2）的抑制作用。LI等将saRNA分子与前列腺特异性膜抗原（PSMA）-靶向配体A10-3.2共轭，共轭体可显著上调PSMA阳性前列腺癌细胞中DPYSL3v 2基因的表达，而对PSMA阴性前列腺癌细胞无明显作用。对前列腺癌裸鼠移植瘤的研究表明，DPYSL3v2-saRNA-PSMA-A10-3.2共轭体可显著上调DPYSL3v2的表达水平，抑制前列腺癌细胞的远处转移。saRNA可特异性上调钠碘转运体（NIS）的表达水平，其中saRNA-482序列上调NIS表达水平最高。体外培养条件下，转染NIS-saRNA的肝癌细胞与未转染细胞的摄碘水平差异明显，其中最高摄碘者较对照组细胞高出64倍；与未转染组肝癌细胞比较，131碘对转染组肝癌HepG2细胞的生长抑制率为60.7%。因此，通过RNAa调控NIS基因表达可介导131碘治疗肝癌的潜力。陈金飚等[9]针对人前列腺癌PC-3细胞构建的Numb-saRNA，可特异性激活人前列腺癌细胞中Numb mRNA和蛋白的表达水平。XIE等[10]发现，靶向saRNA序列可以特异性激活胃癌细胞中Vezatin（VEZT）的表达，上调VEZT mRNA和蛋白的表达水平，抑制胃癌细胞的生长、侵袭和迁移。因此，特异性saRNA可激活目标基因的表达，RNAa现象在多种肿瘤细胞中具有广泛适用性；RNAa可以增强抑癌基因的功能，实现肿瘤基因治疗的目的。 3 saRNA的应用前景 RNAa技术将成为一种新的基因治疗手段。RNAa以 RNA干扰（RNAi）技术为基础，是一种快速、简洁和高效的上调目的基因表达的手段，且克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点。与RNAi技术相比，RNAa具有更直接的分子结合、更强的表达反应和持续时间。与转基因技术相比，RNAa避免了将外源性基因导入体内，可直接激活沉默基因或者上调低活性基因的表达。并且，saRNA在激活目的基因的过程中，有良好的靶向性，可灵活选择靶点，对靶基因作用强效，因此RNAa在基因治疗方面有巨大的优势。另外，与传统的基因过表达手段相比，saRNA还具有构建简单和耗费低等优点。已有学者将此技术运用于肿瘤抑癌基因的激活，结果显示saRNA对肿瘤细胞生长的抑制作用强效，至少持续1周以上。saRNA介导的基因激活在肿瘤发病机制研究和治疗方面具有优势，因此saRNA是基因治疗的又一理想工具。虽然目前RNAa的具体机制还有待进一步研究，但RNAa将有希望成为质粒过表达系统的替代工具。
尽管如此，作为一种新的基因调控手段，saRNA仍然有诸多问题需要解决。首先，构建saRNA需要进行大量激活序列的筛选工作。其次，人工合成saRNA的稳定性较差。在进行体外原代细胞实验或者动物体内实验时，由于其转染效率低，易被降解，因此目标基因的激活效果不佳。再次，不同细胞内saRNA的调控方式不同，存在一定的个体差异。最后，saRNA在体外的激活效果持续时间在1周以上，但RNAa效应需要持续稳定才能对肿瘤组织产生体内抑制作用。如果将saRNA重组至载体上，虽然可以获得稳定激活的效果，但载体所产生的dsRNA可能会导致细胞处理dsRNA的能力达到饱和而影响细胞的正常功能。目前，研究人员正在尝试对saRNA进行化学构架修饰，以解决以上问题。虽然存在诸多未解难题，但是RNAa技术仍然为基因操控研究和癌症精准治疗提供了新的方向。 RNAa作用于不同基因，产生不同的生物学效应，为RNAa技术在肿瘤精准治疗中的应用提供了更多可能。与传统基因治疗方法相比，saRNA在肿瘤治疗方面具有无可比拟的优势，在肿瘤发病机制研究和肿瘤治疗方面均有广阔的应用前景。未来，saRNA介导的基因激活有可能成为肿瘤治疗的新手段。 来源：TUMOR Vol.39,January 2019 |
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