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摘要 由于细胞毒性，卵巢癌（OvCa）抗体治疗令人失望。在此，作者报告了一种与临床试验抗体相比具有高度选择性和优越性的双靶向药物。这种双靶向细胞毒性激活抗体特异性结合FOLR1和DR5诱发“顺式”和“反式”细胞毒性作用。 尽管体内DR5信号需要FcγRIIB 作用，但FOLR1作为主要富集靶点维持肿瘤细胞特异性凋亡。 作者前瞻性地利用肿瘤细胞富集受体作为死亡受体靶向激动剂，为OvCa产生一种临床上可行的治疗策略。卵巢癌（OvCa）是最致命的妇科疾病，目前尚无有效的治疗方法。作者发现单分子抗体治疗存在抗肿瘤局限，联合靶向两个分子的抗体可以克服局限。作者描述的BACA抗体疗法优于Apo2L / TRAIL组合配体和DR5抗体。三种联合抗体结构(baca-1,baca-2,baca-3)选择最佳结构baca-1可以增强死亡受体富集， 并且安全性和肿瘤细胞特异性定位更好。总之，BACA抗体不仅为DR5抗体临床前疗效提供了合理论据，还为死亡受体靶向激活ADCC提供了范例。 图解摘要  背景 靶向单克隆抗体（mAb）利用多种机制消除癌细胞。尽管FDA批准实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的抗体治疗，但抗卵巢癌细胞（OvCa）-富集受体如FOLR1和Ca125的抗体在临床试验中令人失望。这些抗体依赖于IgG1- FcγRIIIA（CD16a）结合，FcγRIIIA是一种广泛表达的免疫球蛋白超家族受体，依赖于自然杀伤细胞（NK）诱导的肿瘤细胞抗体依赖性细胞毒性（ADCC），其临床反应不理想可能是由于NK在肿瘤区域浸润不足和其他免疫效应细胞缺氧。对于高级别浆液性卵巢癌（HGSOC），FOLR1单克隆抗体farletuzumab可改善Ca125低表达患者的存活率。为了在更多卵巢癌患者达到好的临床应用，作者假设FOLR1靶向抗体（farletuzumab）的抗肿瘤活性不受ADCC作用限制。 类似疗法有应用Trail配体（Apo2L）或上皮性肿瘤富集死亡受体5（DR5 / TRAIL-R2）抗体的促凋亡（PARA）疗法。 PARAs通过寡聚化DR5激活外在凋亡途径，DR5是肿瘤坏死因子受体家族成员。尽管DR5抗体单一药剂或与Apo2L联合使用促使DR5受体聚集和抗肿瘤反应，但临床II期实验未能证明PARA疗法具有显着益处。由于DR5受体富集不理想，肿瘤特异性细胞死亡信号不足。作为一种替代方案，反式结合抗体已被描述可增强DR5聚集。作者试图研究联合锚定FOLR1和DR5的双靶向细胞毒性（BaCa）抗体在卵巢癌细胞选择特异性，安全性和抗肿瘤活性中的受益。 Baca抗体的产生、鉴定和筛选 为了共同靶向FOLR1和DR5，基于以下三点设计IgG1 Fc的双特异性抗体：（1）在体内与FcγRIIB和IgG1 CH2结构域结合。（2）Apo2L配体结合活化的DR5受体形成三联结构，每侧约为40 A˚。（3）达到有效的血清半衰期。三种不同联合靶向抗体结构见图1A。 BaCa-1抗体含有FOLR1二价抗体（蓝色）和DR5抗体（红色）。 BaCa-2抗体类似于IgG1，为单克隆抗体。BaCa-3抗体针对FOLR1和DR5的轻链/重链的两个可变结构域通过GS融合。BaCa-1，BaCa-2和BaCa-3连接体长度分别为12GS，45GS和9GS。 BaCa三种结构抗体的性质比较见图1B。BaCa-1抗体不仅对OvCa细胞具有明显的细胞毒性（图1C），而且还表现出比BaCa-2和BaCa-3更高的产率和稳定性。一旦与FOLR1结合，BaCa-3抗体由于空间位阻而无法同时结合DR5，反之亦然（图1A）。96孔板（共固定rFOLR1和rDR5受体）孵育细胞，6 M尿素处理后，Baca-1抗体治疗显示出更高的相对亲和力指数（图1D）。  DR5寡聚和活化是由于BaCa抗体与靶受体结合 用ForteBio Octet HTX确认了BaCa-1的结合动力学（图1E，1G）。FOLR1和DR5的各自单克隆抗体转化为双特异性BaCa抗体构型后与受体结合亲和力保持不变。BaCa抗体细胞毒性差异是由于聚集和激活DR5的能力不同(图1B)。因此，作者构建了非锚定-BaCa（NBaCa）抗体，其中抗FOLR1可变结构域被Praxbind取代，Praxbind是抗凝药物Pradaxa的解毒剂(图1F)。NBaCa抗体对DR5受体具有二价结合作用，NBaCa抗体与lexatumumab一样有效（图1G）。在治疗细胞之前，用rDR5，rFOLR1或两者一起中和BaCa抗体（37℃，1小时）。 rFOLR1中和降低了BaCa对lexatumumab的细胞毒性，而rDR5封闭或rDR5结合域丧失消除了lexatumumab的细胞毒性（图2A）。与lexatumumab相比，BaCa处理的裂解物也显示出高水平的DR5聚集和caspase-3裂解（图2B和2C）。BaCa抗体的DR5受体聚集、信号传导和活性功能依赖于DR5与FOLR1的共同结合。 BaCa抗体是否能改变细胞凋亡动力学和细胞毒性？48小时内两种抗体有效杀死> 99％的细胞（图2D），100nM剂量的早期过程分析反映DR5信号传导的凋亡时间依赖性。如图所示，BaCa抗体在30min和2hr内诱导DR5三聚化（120kDa）和caspase-3活化，而lexatumumab需要3小时才能完成（图2E）。 BaCa抗体在6小时内消除50％的OVCAR-3细胞，而lexatumumab需要12小时（图2F）。 流式实验也获得了类似的动力学结果（图2G和2H）。Baca抗体促进更快和细胞毒性更强的DR5聚集和信号传导。  BACA抗体具有广泛的抗肿瘤特性 将BaCa活性应用到HGSOC细胞中，几乎所有检测的细胞系都表达了高水平的FOLR1(图3A)。在大多数OvCa细胞系中，BaCa抗体始终比lexatumumab具有更高的细胞毒性，并且对患者来源的异种细胞具有明显的细胞毒性（图3B）。非hgsoc的OvCa细胞系SKOV3 对DR5治疗无反应。尽管在转录水平上无差异，但SKOV3细胞中DR5蛋白明显减少（图3A）。SKOV3细胞的RT-PCR和qPCR均检测不到N-乙酰半乳糖胺基转移酶-3（GALNT3）的表达。SKOV3细胞中DR5 O-连锁糖基化缺失限制DR5的疗效。由于Apo2L配体可以通过结合DR4（TRAIL-R1）和DR5受体诱导细胞毒性，作者首先证实OVCAR-3细胞仅表达DR5（图3C）。作者实验室生成的Apo2L与商业Apo2L一起进行测试。比较BaCa抗体（用lexatumumab或AMG-655产生）±Apo2L配体的细胞杀伤活性。 Apo2L配体的共处理不增强BaCa抗体活性（图3D和3E）。无论有无Apo2L配体，BaCa抗体对caspase-3 激活没有变化（图3F）。作者还观察到Apo2L和AMG-655引起的细胞凋亡协同作用（图3E）。 有趣的是，Apo2L和lexatumumab的共同治疗没有引起细胞凋亡协同作用（图3D和3F）。 与lexatumumab不同，AMG-655在诱导OvCa细胞凋亡的作用非常有限，这表明它们的工作机制存在差异。 将FOLR1抗体与另一种癌受体（CDH17）靶向抗体A4交换， CDH17在结肠直肠癌中过表达。 与Lexatumumab相比，A4-BaCa对Colo-205细胞的细胞毒性高出数倍，这表明BaCa靶向治疗其他癌症具有潜力（图3G）。  Baca抗体对FolR1阳性OVCA细胞具有高度选择性 Lexatumumab/AMG-655单独/与Fc结合剂一起培养OVCAR-3细胞。尽管DR5的非特异性结合，单药BaCa抗体更有效（图4A,4B）。理想的抗癌治疗性抗体如BaCa应该能降低对FolR1不表达或低表达细胞的毒性。比较高表达和低表达FOLR1细胞中的BaCa活性： 直肠癌细胞系Colo-205表达的FOLR1比OVCAR-4卵巢癌细胞少5倍，但DR5和GALNT3转录水平相等（图4C）。 在Colo-205和OVCAR-4细胞中，lexatumumab的IC50没有显着差异（图4D）。 然而，BaCa抗体在杀死OVCAR-4细胞方面比Colo-205细胞有效70倍。 这合理解释了细胞毒性对肿瘤特异性FOLR1锚定抗原的依赖性。将稳定表达GFP的Colo-205细胞与OVCAR-4共培养检测细胞毒性是否对OvCa细胞具有选择性（图4E）。 当用0.1nM BaCa抗体处理24-36h时，观察到OVCAR-4细胞选择性消除（图4F）。 Lexatumumab在相同剂量下完全无效。DR5在两种细胞类型中表达相似（图4C）。低剂量时，BaCa抗体对表达FOLR1的肿瘤细胞具有高度选择性，并且更倾向于与DR5结合诱发“顺式”细胞死亡。 高剂量时，观察到BaCa对OVCAR-4和Colo-205细胞的细胞毒性。为了再次确认，将共培养细胞（50％GFP- OVCAR-4和50％GFP Colo-205）与高浓度BaCa抗体一起孵育，高剂量下，BaCa抗体杀死与GFP-OVCAR-4细胞共培养的GFP Colo-205细胞比与GFP - Colo-205细胞共培养的GFP Colo-205细胞更有效（> 5倍）（图 4G和4H）。将GFP Colo-205细胞与小鼠MC38细胞共培养，用50nM LK26-AMG-655双特异性抗体处理。 图4I（最右侧泳道）GFP丢失证实双特异性抗体具有使muFOLR1参与反式激活huDR5的功能。BaCa抗体（Farletuzumab-AMG-655）以比LK26-AMG-655-双特异性抗体低得多的浓度诱导共培养的OVCAR-3细胞杀伤（图4J-4L）。  BaCa抗体的肿瘤特异性 将红外染料IR 800标记抗体静脉注射到荷瘤小鼠体内(图5A)。BaCa抗体在移植瘤24小时内选择性积累，而lexatumumab在肝脏的定位明显高于肿瘤(图5B）。注射前rFOLR1中和BaCa抗体使期肿瘤特异性完全丧失(图5C)。FOLR1中和使得BaCa抗体在小鼠肝中积累，Lexatumumab持续在小鼠肝中积累(图5D)。小鼠肝脏中lexatumumab抗体的累积量是BaCa抗体的5倍(图5E)。单次i.v.剂量的BaCa抗体可使OVCAR-3肿瘤中caspase-3裂解水平增加10倍，rFOLR1预中和BaCa抗体可降低caspase活性和DR5低聚化(图5F-5J)。设计LK26和BaCa (MuBaCa)组成的小鼠交叉反应抗体MD5-1(图5 k）。与huBaCa类似，C57BL/6小鼠移植MC38肿瘤后，muBaCa定位明显比MD5-1抗体高(图5L)。肿瘤和肝脏中muBaCa和MD5-1信号明显增多(图5M, 5N)。MD5-1还导致血清AST和ALT水平升高，这两项指标都是肝毒性的指标(图5O)。  BaCa抗体的抗肿瘤活性 随机选取OVCAR-3裸鼠瘤(>100 mm3)，每3天腹腔注射25 mg抗体(图6A)。BaCa抗体在4次用药后完全逆转肿瘤生长，而lexatumumab仅稳定肿瘤生长。在随后的4周内，6只注射了baca的小鼠均未出现肿瘤再生。BaCa抗体在OVCAR-4细胞产生的肿瘤中也有类似效果(图6B)。WT-Fc(ll234 - 235)包含BaCa和farletuzumab抗体注射于小鼠体内。与BaCa抗体相比，Farletuzumab (WT-Fc)的有效性有限(图6C)。E267S突变的抗体没有抗肿瘤活性(图6D)。BaCa抗体(25 mg)完全逆转OVCAR-4肿瘤，但在相同剂量下对Colo-205肿瘤的疗效有限(图6E)。在使用muBaCa免疫活性的小鼠研究中也观察到类似的效果(图6F)。当检测MC38肿瘤时，chiBaCa对MD5-1同样有效(图6G)。这些研究和caspase-3活性(图6H)实验说明了体内baca靶向治疗的特异抗肿瘤活性。与lexatumumab相比，BaCa抗体稳定了铂耐药肿瘤(图6I)。  讨论 作者假设在同一OvCa癌细胞上，DR5与folr1双靶向抗体（baca抗体）可以获得高度特异的死亡信号传导（图7）。作者发现用AMG-655、lexatumumab或MD5-1产生的BaCa抗体在体外诱导细胞毒性的能力增强。尽管lexatumumab和MD5-1、FcγRIIB激活DR5信号有其局限性，但在相同的治疗剂量下，BaCa抗体能将细胞凋亡阈值显著提高到FcγRIIB的激活极限。DR5与FOLR1联合抗体获得更强的抗肿瘤反应可能有以下几个原因:(1)保持了FcγRIIB结合，(2)提高了FcγRIIB亲和性和稳定性，(3)是这两个或其他未知事件的组合。尽管FcγRIIB、DR5等调控因子在肿瘤中高表达，但DR5抗体是否能在临床上产生可应用的结果在很大程度上取决于其是否具有诱导凋亡信号的优越性。体外实验表明lexatumumab可诱导细胞凋亡，而AMG-655和MD5-1除非结合，否则不能诱导细胞凋亡。Apo2L AMG-655与Apo2L lexatumumab的凋亡协同效应也存在差异。与AMG-655不同的是，lexatumumab与DR5结合是否影响DR5- apo2l复合物的构象还有待晶体学研究。高浓度Baca下表达FOLR1的癌细胞更容易凋亡，可能与形成锚定复合物诱发''顺式''凋亡过程有关。与较低的有效剂量相比，较高的治疗剂量是否具有更高的毒性和获得耐药性的可能性还需要在临床试验中观察。无论是顺式还是反式信号转导，BaCa抗体都对表达FOLR1的OvCa癌细胞产生有效的抗肿瘤反应。除了有效性，BaCa介导的高亲和力锚定三元复合物也在安全性、肿瘤细胞特异性和治疗性抗体保留时间上提供了重要的见解。此外，FOLR1表达肿瘤细胞中caspase-3的选择性十倍激活并未引发局灶性肝炎，强调了BaCa治疗的临床安全性。  参考文献：Shivange, G., et al., A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell, 2018. 34(2): p. 331-345 e11. 关注微信公众号“百味科研芝士”，一个分享干货的地方 |
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