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抑郁症作为一种常见的情感精神障碍疾病，严重危害人类身心健康，给社会和家庭带来沉重的负担[1]。世界卫生组织预言2020年抑郁症将会成为第二大临床慢性疾病[2]。目前，抑郁症的治疗仍以药物治疗为主，多数化学抗抑郁药（如三环抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂等）不良反应多、起效慢、易复发，不能满足临床患者需求，而一些中药或中药复方在预防和治疗抑郁症主症和兼症方面表现出良好的效果，不良反应较少发生，逐渐成为研究的重点和热点[3-4]。 栀子豉汤出自汉代张仲景的《伤寒杂病论》，由栀子和淡豆豉2味药组成。针对栀子豉汤的抗抑郁作用已有文献报道。高芳[5]研究结果表明栀子豉汤能够使抑郁症大鼠体质量增加，同时对血中多巴胺、5-羟色胺、三酰甘油等物质的量起到调节作用，证明了栀子豉汤具有一定的抗抑郁作用。蔡絜如[6]对栀子豉汤治疗轻度抑郁症进行了临床观察，结果显示栀子豉汤治疗轻度抑郁症的总有效率达94.05%。彭国茳等[7]对栀子中京尼平的抗抑郁机制进行了 靶点、成分-靶点-疾病、成分-靶点-通路等网络来阐明药物的作用机制，非常适合于多成分、多靶点的中药复方作用机制的研究[9-10]。 高耀等[11-12]采用PharmMapper方法研究了逍遥散和交泰丸抗抑郁主要活性成分的作用靶点，探讨其多成分-多靶点-多通路的作用机制。赵蕾等[13]通过ClueGO插件对百合地黄汤抗抑郁靶点的基因功能及代谢通路进行分析，揭示了百合地黄汤干预心理亚健康的作用机制。Trindade等[14]采用String、Cytoscape、ClueGO结合CluePedia等生物信息工具，探讨了2种心血管疾病-主动脉瓣狭窄（AVS）和冠状动脉疾病（CAD）的病理生理学和潜在生物标志 材料和方法 1.1 软件与数据库 TCMSP（http://lsp./, Version 2.3）、PubChem（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemicalBook（http://www.chemicalbook.com/）、PharmMapper（http://59.78.96.61/pharmmapper/， Update in 2016-12-28）、UniProt数据库中UniProtKB GeneCards数据库（http://www./, Version4.5.0）、 Cytoscape软件（Version 3.4.0）、String数据库（https:///， Version 10.5）、Systems dock Web Site（http://systemsdock.unit., Version 2.0）、ChembiodrawUltra软件（Version12.0）。 1.2 化学成分的获取与活性成分的筛选 通过TCMSP数据库获取栀子豉汤2味药的化学成分，再结合文献挖掘与整理，依据化合物在单味药中的含量、研究热度和相关生物学功能等标准筛选出已报道的栀子豉汤的主要活性成分。 1.3 作用靶点的获取 所得的活性成分在Chembiodraw Ultra软件中绘制出各自的结构图，并以SDFile（*.sdf）格式存储。并利用PubChem、ChemicalBook和TCMSP平台对其分子结构进一步确证。登陆PharmMapper服务器，上传上述栀子和淡豆豉活性成分的SDFile（*.sdf）格式文件，获得虚拟筛选结果。利用UniProt数据库中UniProtKB搜索功能，输入蛋白名称，限定物种为人，限定输出前300个靶点，将靶点校正为官方名称（official symbol）。 1.4 抑郁症相关靶点的筛选 通过在GeneCards数据库中输入关键词depression、depressive、depressed和antidepressant搜索已报道的和抑郁症相关的基因，去除重复基因和假阳性基因，与上述PharmMapper服务器中返回的靶点进行匹配，得到栀子豉汤活性成分的抗抑郁潜在作用靶点。 1.5 网络构建与分析 将获得的栀子豉汤的活性成分和作用靶点信息导入Cytoscape软件，构建活性成分-作用靶点网络。 将栀子豉汤的作用靶点导入String数据库，利用Multipleproteins工具，限定物种为人，获取蛋白相互作用，并保存其TSV格式文件。将文件中的node1、node2和combined score信息导入Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络，并对网络进行分析。在Cytoscape的generate style from statistics工具中将靶点大小和颜色设置用于反映degree的大小，边的粗细设置用于反映combinescore的大小，从而获得最终的蛋白相互作用网络。 1.6 分子对接验证 Systems dock Web Site是一个基于网络药理学预测和分析的网络服务器，它应用高精度对接模拟和分子通路图，全面表征配体选择性，并说明配体如何作用于复杂的分子网络。它具有DocK-IN评分的分子对接功能，以评估蛋白质-配体结合潜力[16]。用systems dock Web Site对相互作用网络中degree值靠前的6个靶点与栀子豉汤的16个成分进行分子对接验证。 1.7 生物功能和通路分析 结果 2.1 栀子豉汤活性成分的筛选 TCMSP数据库中分别得到栀子化学成分98个、淡豆豉化学成分15个。经大量的文献挖掘与整理，根据在单味药中的含量、生物学功能、研究热度等筛选出栀子豉汤具有生物活性的成分16个。除了绿原酸、大豆皂苷I、大豆皂苷II、大豆皂苷III和大豆皂苷Ab外，其余成分TCMSP数据库均有收录。其中栀子活性成分7个，分别为京尼平苷、京尼平、京尼平苷酸、西红花酸、西红花苷I、熊果酸和绿原酸。淡豆豉活性成分9个，分别为大豆苷元、染料木苷、染料木黄酮、黄豆黄素、大豆苷、大豆皂苷I、大豆皂苷II、大豆皂苷III和大豆皂苷 Ab。见表1。 2.2 靶点预测 2.3 活性成分-靶点网络构建与分析 2.4 蛋白相互作用网络构建 将上述栀子豉汤的43个靶点导入String数据库中，限定物种为人，从而获得蛋白相互作用关系（IMPA1、IMPA2、ADH1C未在数据库中找到，还有一些蛋白与其他蛋白没有相互作用，这些均不在相互作用网络中体现），导入Cytoscape软件中构建蛋白相互作用网络，见图2。图2中的节点表示蛋白，边表示蛋白间的相互关联，共涉及36个节点，204条边。用节点的大小和颜色表示degree值的大小，节点越大对应的degree值越大，颜色由红变蓝对应的degree值越大。用边的粗细表示Combine score值的大小，边越粗Combine score值越大。 2.5 分子对接 与 2.6 生物功能与通路分析 使用ClueGO结合CluePedia插件对栀子豉汤活性成分对应的43个作用靶点的生物功能和通路进行分析，见图3。图3显示栀子豉汤的作用靶点主要涉及细胞、组织、器官、代谢、免疫、对应激的应答等过程，这反映了抑郁症作为一种复杂的疾病涉及多种生物过程，栀子豉汤可以通过调节这些生物过程来发挥抗抑郁作用。栀子豉汤作用靶点的通路分析见图4。图4显示栀子豉汤的作用靶点主要涉及瘦素（leptin）、雌激素（estrogen）、丝裂原活化蛋白激酶级联（MAPK cascade）、脑源性神经营养因子-酪氨酸激酶受体（BDNF-TrkB）、5-羟色胺受体（5-HT receptor)、白细胞介素（IL）等信号通路，这表明栀子豉汤作用靶点存在于多个通路，可以通过调节不同的通路来发挥抗抑郁作用。 讨论 栀子豉汤由栀子和淡豆豉2味药组成。栀子主要成分有环烯醚萜苷、栀子黄素和有机酸，其中京尼平苷、西红花苷、西红花酸、绿原酸和熊果酸含量较高[18-21]。研究表明，京尼平苷、京尼平[22]和西红花苷-I[23]具有一定的抗抑郁作用；西红花酸具有抗肿瘤和神经保护等作用[24-28]；京尼平苷酸是京尼平苷的衍生物，具有抗炎和抗氧化等作用[29-30]；绿原酸为多种中药中的活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、增强免疫力等作用[31]；熊果酸在许多人类疾病中均发挥着作用，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等作用[32]。淡豆豉中大豆异黄酮与大豆皂苷成分逐渐成为近年来的研究热点。目前对大豆异黄酮类成分研究较多的是大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木黄酮，但也有研究表明游离苷元（大豆苷元和染料木黄酮）才是大豆异黄酮主要活性组分[33]。研究表明大豆皂苷类成分具有溶血、降低胆固醇和三酰甘油、抑制肿瘤细胞生长等作用[34]。但大豆皂苷类成分复杂，对大豆总皂苷生物功能报道的居多，而对单个大豆皂苷成分则报道较少，其中以大豆皂苷I和大豆皂苷II、大豆皂苷Ab、大豆皂苷III报道的相对较多。这表明栀子豉汤活性成分筛选具有一定的依据。 栀子豉汤活性成分-作用靶点网络（图1）结果与中药多成分-多靶点的特点一致。蛋白相互作用网络（图2）结果显示栀子豉汤作用靶点并非单独起作用，靶点间存在着相互作用关系，为一个互作的复杂网络。分子对接结果（表5）可知重要靶点与活性成分的结合能力较好，为之后网络分析奠定了好的基础。作用靶点的生物功能分析结果（图3）反映了抑郁症作为一种复杂的疾病涉及体内多种生物过程，这与相关文献报道一致[35-37]。 栀子豉汤作用靶点的通路分析结果显示，MAPK级联途径为胞内主要的信号转导系统，主要包括Ras-ERK、p38MAPK等信号通路，该级联途径与脑的发育、神经细胞膜表面受体、神经递质作用和神经细胞凋亡等过程有关[38]。脑源性神经营养因子（BDNF）为一种重要的神经营养因子，在神经元的存活和功能维持上发挥着重要的作用。BDNF通过与酪氨酸激酶受体（TrkB）结合，促使CREB磷酸化，从而促进相关蛋白（如BDNF基因）的转录来发挥作用。5-HT为一种重要的单胺类神经递质，其受体在抑郁症的形成中起着重要的作用，为单胺特异受体药物研发的热点和重点。IL为重要的细胞因子，在抑郁症炎症反应中发挥作用。瘦素为一种脂肪细胞分泌的蛋白类激素，可能与脑内结构的改变、神经递质功能、HPA轴的功能有关[39]。研究表明，血浆、中枢瘦素水平均与抑郁症状相关，局部中枢注射瘦素可以起到抗抑郁效果[40-41]。栀子豉汤可能通过影响血浆瘦素水平发挥作用，也可能通过影响瘦素在中枢的功能发挥作用。 雌激素对抑郁症的发生起着重要的作用。研究表明，血清、海马雌激素/雌激素受体水平与抑郁症状相关[42-43]，雌激素可以通过影响脑中单胺类神经递质发挥抗抑郁作用[44]。栀子豉汤可能通过影响体内雌激素水平发挥作用，也可能通过影响雌激素在脑中的功能发挥作用。提示栀子豉汤发挥作用可能是脑内直接作用与脑外间接作用共同作用的结果。 综上所述，筛选出的栀子豉汤16个活性成分具有一定的研究意义与依据。栀子豉汤的抗抑郁作用涉及细胞、组织、器官、代谢、免疫、对应激的应答等多个过程；与神经营养因子、细胞因子、神经递质、激素等物质有关，通过调节瘦素、雌激素、MAPK级联、BDNF-TrkB、5-HT受体、IL等信号通路来发挥抗抑郁作用。文献报道与分子对接结果表明网络药理学方法预测具有一定的准确性。本研究结果充分体现了栀子豉汤多成分-多靶点-多通路的抗抑郁作用特点，为进一步开展栀子豉汤抗抑郁作用机制的研究提供了新思路。此外，本课题组对栀子豉汤的活性成分及抗抑郁作用机制的实验研究也正在进行中。 |
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