一种治疗白血病和多发性骨髓瘤的化合物的制作方法

专利名称：一种治疗白血病和多发性骨髓瘤的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，进一步是指化合物单体——石蒜碱。
背景技术：
白血病和多发性骨髓瘤是常见的血液系统恶性肿瘤，其发病率很高，我国白血病患者约为3～4人/10万人口，西方发达国家的发病率普遍高于我国，如美国发病率为6.8～9.3人/10万人口；而我国多发性骨髓瘤约为1人/10万人口，西方发达国家为4人/10万人口。治疗白血病和多发性骨髓瘤的药物种类很多，疗效各异，绝大多数为化学合成药物，这些药物的副作用大，而且不能根治。近年来国外相继开发出一些针对性强、疗效较好、副作用相对较小的新型化疗药，但价格昂贵。因此，寻找具有自主知识产权的新的抗肿瘤天然药物，具有重大的经济效益和社会效益。迄今为止，从天然植物中已找到了一系列结构新颖和作用独特的化合物。已发现的从植物中提取的抗癌新药包括紫杉醇类抗癌药、喜树碱类抗癌药、鬼臼毒素类衍生物、雷公藤内酯醇类化合物、青蒿琥酯、沙尔威辛、茶多酚，以及人参皂甙、揽香烯、薏苡仁油、大蒜中的抗癌成分、抗前列腺癌植物药PC-SPES等中药抗癌药等。
进一步从天然植物中寻找、开发新的抗肿瘤药物，仍然是人们努力的方向。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出治疗白血病和多发性骨髓瘤的天然化合物单体，对所述病症有明显疗效，且社会效益和经济效益巨大。
本发明的技术解决方案是，所述治疗白血病和多发性骨髓瘤的天然化合物石蒜碱(又名水仙碱，lycorine)单体，系从石蒜科植物中制得，其分子式为C16H17NO4，化学结构式为 盐酸石蒜碱(lycorine hydrochloride)的分子质量为323.77；熔点为210～212℃。化学性质为碱性，呈粉末状结晶。微溶于乙醇，不溶于水和氯仿，可溶于DMSO。
在本发明中，使用石蒜碱通过静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
以下对本发明做出进一步说明。
本发明研制者经过几年的努力，从我国石蒜科(Amaryllidaceaefamily)植物水仙(Chinese Narcissus Bulb，Narcessus tazetta L.)和其他石蒜科植物中找到对白血病和多发性骨髓瘤细胞有明显抑制作用的天然化合物单体——石蒜碱(又名水仙碱，lycorine)。通过一系列实验，发现石蒜碱单体的作用是通过抑制细胞内蛋白质合成、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡来实现的。通过建立小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型，用石蒜碱进行治疗，发现石蒜碱可以显著降低小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型的血液中未分化粒、单核细胞百分率，改善白血病和多发性骨髓瘤小鼠的血像，使白血病和多发性骨髓瘤小鼠的生存期延长，死亡率降低，是一种治疗白血病和多发性骨髓瘤的有效新药。石蒜碱的作用明显优于阿糖胞苷(Ara-C)和美法仑(Melphalan)。
同时石蒜碱可以与其他治疗白血病和多发性骨髓瘤的药物搭配使用，形成复合药物。以降低这些药物的使用量，从而降低毒、副作用，提高疗效。实验发现，石蒜碱的安全性高于其他常见治疗白血病和多发性骨髓瘤的药物。目前国内外尚未见到该药用于白血病和多发性骨髓瘤治疗的报道和相关研究。本发明的实验包括1.细胞增殖抑制试验将石蒜碱加入到多种白血病细胞株、多发性骨髓瘤细胞株和其他恶性肿瘤细胞株中培养，用流式细胞检测技术，荧光检测技术等方法，进一步证实对这些细胞有非常明显的抑制作用，其作用是通过抑制蛋白质合成、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡来实现的。
用石蒜碱分别处理白血病和多发性骨髓瘤细胞株，发现细胞体积变小，细胞稀少，细胞增殖速度受到明显抑制，而且呈现石蒜碱浓度依赖性(图1A、1B、1C)。
2.软琼脂集落形成实验将不同剂量的石蒜碱分别加入到白血病和多发性骨髓瘤细胞株的软琼脂培养体系中，证实石蒜碱能抑制白血病和多发性骨髓瘤细胞株的软琼脂集落形成数目，有效降低白血病和多发性骨髓瘤细胞株的恶性程度。同时我们以小白鼠骨髓细胞作为正常细胞进行原代培养，加入石蒜碱后，观察小鼠成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数目。实验证实，治疗剂量的石蒜碱能特异性抑制白血病和多发性骨髓瘤细胞株的生长，而对正常细胞的毒性很小。图2和表1为HL-60细胞的软琼脂集落形成实验结果。
表1 石蒜碱对细胞克隆形成的影响组别石蒜碱浓度(μg/ml) 克隆数 (per 1.5×103cell)HL-600 179±270.196±170.225±90.43±2K562 0 207±180.144±130.28±30.42±23.抗癌药物敏感性试验用MTT方法检测细胞存活状况，结果发现，低浓度的石蒜碱就能降低肿瘤细胞的存活率，与对照组比较，呈现剂量依赖型效应。此结果证实石蒜碱具有很强的抗癌敏感性。
4.促进肿瘤细胞凋亡试验①将石蒜碱与白血病和多发性骨髓瘤细胞株一起培养，用荧光显微镜观察，发现对照组细胞几乎全呈绿色，染色均匀，细胞核结构正常(图3A)。实验组中有大量细胞体积缩小，核浓缩，核呈浓集的绿色或桔黄色荧光，为早期凋亡细胞(图3B)。小部分细胞具有核碎裂及凋亡小体等现象，为晚期凋亡细胞(图3C)。石蒜碱作用于白血病细胞株1天后，用流式细胞仪定量检测，发现石蒜碱有促进白血病细胞的凋亡作用(表2)。
表2 石蒜碱对HL-60、K562细胞凋亡的影响结果(X±s)(n＝3)

②经石蒜碱诱导HL-60细胞后，提取细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，发现DNA梯状带形成，显示石蒜碱可诱导白血病细胞凋亡(图4)。
③经石蒜碱诱导使白血病细胞周期分布明显改变用1.6μg/ml石蒜碱诱导HL-60细胞1天后，流式细胞仪检测细胞周期中各期细胞的百分率，发现HL-60细胞实验组G2/M期细胞的百分率明显上调(图5A、5B)，提示石蒜碱诱导阻断HL-60细胞周期在G2/M期(表3)。K562细胞实验组S期细胞的百分率明显上调(图5C、5D)，提示石蒜碱阻断K562细胞周期在S期(表3)，从而抑制细胞增殖。
表3 实验组与对照组细胞周期分布比较(X±s)(n＝3)组别 G0/G1细胞(％)S细胞(％)G2/M细胞(％)HL-60 对照组51.00±9.1944.6±4.95 4.4±4.24实验组52.30±11.30 36.05±7.0011.70±3.96K562对照组42.20±2.4 47.47±1.9010.30±2.26实验组40.83±5.2455.20±2.693.96±3.91
④石蒜碱对白血病细胞系(HL-60、K562)和多发性骨髓瘤细胞系中促凋亡相关基因的表达有明显上调作用。
5.石蒜碱对HL-60细胞的半数抑制率(IC50)为0.46μg/ml。
6.石蒜碱的小鼠致死试验石蒜碱对小鼠的半数致死量分别为124mg/kg(静脉)和112mg/kg(腹腔)。
7.动物模型试验将培养的白血病和多发性骨髓瘤细胞株注射入SCID小鼠腹腔，建立SCID小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型，用石蒜碱进行治疗，发现石蒜碱均能显著降低小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型的血液中未分化粒、单核细胞百分率，改善白血病和多发性骨髓瘤小鼠的血像，使白血病和多发性骨髓瘤小鼠的生存期延长，死亡率降低，其作用明显优于阿糖胞苷(Ara-C)和美法仑(Melphalan)。从而证实石蒜碱是一种治疗白血病和多发性骨髓瘤的有效新药。
将体外培养增殖的HL-60细胞经腹腔注射入SCID小鼠体内，使细胞数达到每只SCID小鼠107个。实验组于接种细胞后的第二天开始给予石蒜碱治疗(6.7mg.kg1.d1、20mg.kg1.d1，i.p.)，同时设生理盐水(N.S.)阴性对照组(NC)和阿糖胞苷(Ara-c)阳性对照组。分别于接种前及接种后第7、14、21、28天经尾静脉取SCID小鼠外周血进行白细胞计数及分类。结果发现在各时期对照组的外周血白细胞中未成熟粒、单核细胞百分率均高于实验组，P＜0.05(见表4、表5、图6、图7)。且石蒜碱的高、低治疗组之间疗效有一定差异(见表4)。
表4 各组小鼠接种HL-60细胞后外周血中未成熟的粒、单核细胞百分率(n＝6，X±s)

注各P值为同一时期内不同实验组与对照组进行比较表5 不同浓度的石蒜碱治疗组外周血中未成熟的粒、单核细胞百分率(n＝6，X±s)组别 第7天第14天第21天 第28天石蒜碱(6.7mg.kg1.d1) 29.83±5.19 25.33±6.10 22.00±5.44 18.00±8.60石蒜碱(20mg.kg1.d1)21.80±6.30 18.20±2.78 19.17±8.21 14.67±3.14t值 2.3232.438 0.7050.892P值 0.0450.037 0.4970.3948.石蒜碱不但可以单独使用，还可以与其他治疗白血病和多发性骨髓瘤的药物搭配使用，形成复合药物，以降低这些药物的使用量，达到降低毒、副作用，提高疗效的目的。实验证实，石蒜碱的安全性高于其他常见治疗白血病和多发性骨髓瘤的药物。
9.对石蒜碱单体进行化学修饰，烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
10.对石蒜碱单体进行化学修饰，烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，这些衍生物与其他药物搭配使用，形成复合药物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
本发明药物的用途有1.使用石蒜碱单体通过静脉、腹腔等方式给药，用于对白血病和多发性骨髓瘤的治疗。
2.使用石蒜碱单体与其他药物搭配，形成复合药物，通过静脉、腹腔等方式给药，用于对白血病和多发性骨髓瘤的治疗。
3.对石蒜碱单体进行化学修饰，如烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，使用这些衍生物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
4.使用上述石蒜碱衍生物与其他药物配伍，形成复合药物，通过静脉、腹腔等方式给药，用于对白血病和多发性骨髓瘤的治疗。
由以上可知，本发明为治疗白血病和多发性骨髓瘤的化合物单体——石蒜碱及其衍生物，对白血病和多发性骨髓瘤细胞株及其动物模型均有明显疗效。实验证实石蒜碱系通过抑制细胞蛋白质合成，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡而达到治疗目的。


图1中A为石蒜碱对HL-60细胞的生长抑制作用曲线；B为不同浓度石蒜碱对HL-60细胞的抑制作用；C为石蒜碱对K562细胞的生长抑制作用曲线。
图2是HL-60细胞的克隆形成图，其中A为对照组，B为实验组(石蒜碱0.4μg/ml)。
图3是荧光显微镜下OA+EB染色后的对照组和实验组ARH-77细胞(原图为彩图)，图中显示出石蒜碱导致的多发性骨髓瘤细胞凋亡，图中A为对照组(250×)；B为实验组(石蒜碱2.5μg/ml)(250×)；C为实验组(石蒜碱2.5μg/ml)(250×)。
图4中A是经石蒜碱作用的HL-60细胞DNA电泳图，其中1Marker；2对照；3石蒜碱(1.6μg/ml)。
图5是流式细胞仪检测石蒜碱对HL-60、K562细胞周期的影响，图中A为HL-60对照组；B为HL-60实验组(石蒜碱1.6μg/ml)；C为K562对照组；D为K562实验组(石蒜碱1.6μg/ml)。
图6是SCID小鼠接种HL-60细胞后外周血中未成熟粒、单核细胞百分率变化曲线。
图7是小鼠接种HL-60细胞后外周血涂片(第28天)，其中A为未治疗组(1500×)，B为石蒜碱组(1500×)。
具体实施例方式
1.石蒜碱处理白血病和多发性骨髓瘤细胞株，发现细胞体积变小，细胞稀少，细胞增殖速度受到明显抑制。用流式细胞检测技术、荧光照相技术、电镜技术、基因体外扩增技术、凝胶电泳技术等，进一步证实石蒜碱对这些细胞的抑制作用是通过抑制蛋白质合成、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡来实现的。
2.将不同浓度的石蒜碱分别加入到白血病和多发性骨髓瘤细胞株的软琼脂培养体系中，证实石蒜碱能抑制白血病和多发性骨髓瘤细胞株的软琼脂集落形成数目，有效降低白血病和多发性骨髓瘤细胞株的恶性程度。同时我们以小白鼠骨髓细胞作为正常细胞进行原代培养，加入石蒜碱后，观察小鼠成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数目。结果发现石蒜碱对正常细胞的毒性明显小于对白血病和多发性骨髓瘤细胞株的毒性作用。从而证实石蒜碱能特异性抑制白血病和多发性骨髓瘤细胞株的生长，而对正常细胞的毒性很小。
4.抗癌药物敏感性试验用MTT方法检测细胞存活状况，对石蒜碱的作用机制进行了进一步研究。结果发现，低浓度的石蒜碱就能降低细胞的存活率，与对照组比较，呈现石蒜碱剂量依赖型效应。此结果证实石蒜碱具有很强的抗癌敏感性。
5.促进肿瘤细胞凋亡试验将石蒜碱分别与白血病和多发性骨髓瘤细胞株一起培养，用荧光显微镜观察，发现对照组细胞几乎全呈绿色，染色均匀，细胞核结构正常；实验组中大量细胞体积缩小，核浓缩；核呈浓集的绿色或桔黄色荧光，为早期凋亡细胞；小部分细胞具有核碎裂及凋亡小体等现象，为晚期凋亡细胞。1.6μg/ml的石蒜碱作用白血病细胞株1天后，用流式细胞仪定量检测，发现石蒜碱有促进白血病和多发性骨髓瘤细胞的凋亡作用。
经石蒜碱诱导白血病和多发性骨髓瘤细胞后，RT-PCR检测到这些细胞中促凋亡相关基因的表达明显上调。流式细胞仪检测到凋亡细胞增加。同时提取细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，结果进一步显示石蒜碱可诱导肿瘤细胞凋亡。
6.石蒜碱使肿瘤细胞周期分布明显改变用石蒜碱作用白血病和多发性骨髓瘤细胞1天后，流式细胞仪检测细胞周期中各期细胞的百分率，发现HL-60细胞实验组G2/M期细胞的百分率明显上调，提示石蒜碱阻断HL-60细胞周期在G2/M期。K562细胞实验组S期细胞的百分率明显上调，提示石蒜碱阻断K562细胞周期在S期，从而抑制细胞增殖。
7.石蒜碱对K562细胞的半数抑制率(IC50)为0.46μg/ml。
8.石蒜碱的小鼠致死试验石蒜碱对小鼠的半数致死量分别为124mg/kg(静脉)和112mg/kg(腹腔)。
9.动物模型试验将培养的白血病和多发性骨髓瘤细胞株注射入SCID小鼠腹腔，建立SCID小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型，用石蒜碱进行治疗，发现石蒜碱可以显著降低小鼠白血病和多发性骨髓瘤模型的血液中未分化粒、单核细胞百分率，改善白血病和多发性骨髓瘤小鼠的血像，使白血病和多发性骨髓瘤小鼠的生存期延长，死亡率降低，其作用明显优于阿糖胞苷(Ara-C)和美法仑(Melphalan)。从而证实石蒜碱是治疗白血病和多发性骨髓瘤的有效新药。
10.石蒜碱单体与其他药物搭配使用，形成复合药物，以静脉、腹腔等方式给药，形成用于治疗白血病和多发性骨髓瘤，毒、副作用低，疗效更好的复合药物。
11.石蒜碱单体进行化学修饰，如烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
12.对石蒜碱单体进行化学修饰，烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，这些衍生物与其他药物搭配使用，形成复合药物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
一、申请发明专利或实用新型专利必须提交说明书，一式两份(原件及复印件各一份)。
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(正文内容)具体实施方式
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七、说明书在两页以上的应当在每页下框线居中顺序编写页码。
权利要求
1.一种治疗白血病和多发性骨髓瘤的天然化合物石蒜碱(lycorine)单体，其分子式为C16H17NO4，化学结构式为 盐酸石蒜碱的分子质量为323.77；熔点为210～212℃。化学性质为碱性，呈棱柱状结晶，微溶于乙醇，不溶于水和氯仿，可溶于DMSO。
2.石蒜碱单体可以通过静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
3.根据权利要求1所述的石蒜碱单体，与其他药物搭配使用，以静脉、腹腔等方式给药，形成毒、副作用低，疗效更好的复合药物，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
4.根据权利要求1所述的石蒜碱单体，对其进行化学修饰，烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，以静脉、腹腔等方式给药，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
5.根据权利要求4所述的石蒜碱单体，对其进行化学修饰，烷基化、氧化、羧基化和羟基化后形成的衍生物，与其他药物搭配使用，以静脉、腹腔等方式给药，形成毒、副作用低，疗效更好的复合药物，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
全文摘要
本发明公开了治疗白血病和多发性骨髓瘤的化合物单体——石蒜碱。石蒜碱单体及其衍生物，通过多种途径给药，可用于治疗白血病和多发性骨髓瘤；也可以与其他药物搭配使用，治疗白血病和多发性骨髓瘤，降低毒、副作用，组成疗效更好的复合药物。本发明所述的石蒜碱单体及其衍生物通过抑制细胞蛋白质合成，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡而达到治疗白血病和多发性骨髓瘤的目的。
文档编号A61K31/475GK1562022SQ20041002300
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月24日 优先权日2004年3月24日
发明者胡维新, 刘静, 何莉芳 申请人:中南大学