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本文由墨玉曼巴编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转载。 导读 肠道微生物在人类健康和疾病中都起到十分重要的作用。肠道免疫系统可以保护肠粘膜免受病原体侵害。我们希望了解肠道免疫系统激活后是如何影响肠道微生物群落结构的组成和功能。然而，目前许多实验并没有详细充分规范的实验流程来研究免疫应答。本文，主要讨论在研究慢性疾病中遇到的这些问题和挑战。 论文ID 原名：Innate Immune Influences on the Gut Microbiome: Lessons from Mouse Models 译名：固有免疫对肠道微生物的影响：由老鼠模型得出 期刊：Trends in Immunology IF：14.188 发表时间：2018年 通信作者：Dana J. Philpott 通信作者单位：多伦多大学免疫学院 综述内容 1. 微生物与人类的关系 人类的健康依赖于肠道免疫系统和常驻微生物群落之间稳定可恢复的共生关系。肠道微生物群落的组成和多样性的改变，称为菌群失调。菌群失调与许多人类疾病有关，例如炎症性肠病（IBD），其包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。IBD与固有免疫基因的突变有关。因此，在IBD疾病患者中，宿主免疫功能失调和微生态失衡之间的关联可能是受免疫因子控制的机体产物引起的。 IBD可能是起源于微生物群落与微生物生态失调引起的免疫应答。因此，肠道免疫系统重塑肠道菌群这一想法赢得了广泛关注。然而，我们对着这一领域还不是十分了解。很大程度上是由于缺少对肠道内部生态系统运作机制即微生物群落的了解。本文中，我们介绍肠道菌群和免疫系统的知识，并探讨固有究免疫系统如何在体内平衡和炎症反应期间重塑肠道微生物群落。 2. 疾病中的微生态失调：是鸡还是鸡蛋？实验设计的重要性 研究人员通常使用功能缺失的动物模型研究宿主免疫和疾病表型之间的关系。然而，肠道微生物群落在许多旨在分离基因驱动的小鼠研究中一直是重要且未被充分认识的混杂变量。因此，由于缺乏对基因功能清楚的认识，一些缺少严格控制变量的试验模型（野生型WT和敲除组KO）应用于疾病研究中。导致我们不可能完全了解疾病研究中基因型对于肠道微生物群落的影响。 使用标准的方法均一化WT和KO的肠道微生物群落，即使用F2代同窝产生的杂合子（图1）。这种方法可以确保窝内包含WT(+/+)和KO(-/-)基因型并都有相同的微生物群落且生长环境一致。另一个方法是控制变量，控制影响实验动物肠道微生物群落的变量，包括：具有相同肠道微生物菌群的WT和KO和从WT和KO幼崽开始进行研究等。每种方法都有一定的缺点。此外，我们感兴趣的基因对肠道微生物群落的影响可能难以确定。还有重要的一点是，研究设计中缺乏标准化的肠道微生物群落往往会妨碍了解疾病模型中免疫调节的特定机制。 图1 小鼠疾病模型中微生物群落的基线控制方法。 3. 体内平衡：固有免疫对微生物群落的影响很小 3.1 以岩藻糖转移酶2 （FUT2）为例 在体内平衡期宿主“培育”肠道微生物群落这一想法最初是在研究缺乏O-糖基化基因的小鼠中提到的，例如Fut2，负责在肠上皮细胞表面增加岩藻糖的一种酶。特别是，大量微生物配体系统激活Toll样受体（TLRs）增加了小鼠上皮细胞的岩藻糖基化。这些宿主衍生的聚糖大部分被肠道微生物作为代谢底物消耗掉了。此外，全基因组关联研究表明FUT2突变会增加患有克罗恩疾病的风险。分析FUT2突变小鼠和FUT2缺失小鼠的肠道微生物群落结构，都鉴定到了微生物群落组成的改变，都增加了代谢碳水化合物和脂质的微生物群落的丰度。然而，最近研究克罗恩疾病患者的结果表明，FUT2与微生物群落组成和多样性没有明显的关系。因此，一个可以强烈的改变肠道生态系统的基因缺失在体内平衡的状态下对肠道菌群的结构影响很小。 3.2 以髓样分化因子（MyD88）为例 一般来说，肠道固有免疫系统通过调节粘膜表面上粘液和抗菌物质的分泌来塑造肠道微生物群落的整体生态，这些粘液表面将宿主与肠道微生物群落分开。基因缺陷大大减少了传感模式识别受体的功能，主要是TLR或Nod样受体（NLR）蛋白，已被假设可以改变肠道的免疫全局，从而改变肠道微生物群的组成和功能。例如，TLRs通过接头蛋白MyD88来检测大量微生物配体和信号。MyD88对于在结肠中表达抗菌基因是必不可少的，这些抗菌基因主要是在上皮细胞中编码RegIIIβ和RegIIIγ。细菌丰度的差异是否会诱导基因表达的变化，在没有同窝对照的情况下难以确认。然而，另一研究发现，MyD88缺失的小鼠中小肠上皮细胞表面的细菌丰度明显增加，而管腔内细菌没有明显变化。这一研究表明，尽管MyD88可能没有调节肠道内全部细菌，但是可以通过激活RegIIIγ促进微生物从小肠上皮分离造成物理隔离而起到加强上皮细胞屏障的作用。因此，采样位置可能是研究MyD88的一个重要的考虑因素。 3.3 以NLRP6炎症复合物为例 Nlrp6是NLR受体，在小肠和直肠的肠细胞和杯状细胞中高度表达，形成的胞质蛋白复合物是一种炎症复合物。这种炎症复合物主要功能是通过调节尚未明确的微生物或有害的配体将其无活性酶原1裂解成活性形式，然后通过蛋白水解系统激活炎症细胞因子1L-1β和1L-18。Nlrp6炎症复合物是否可以调节小鼠肠道微生物群落仍然存在争议。关于一个特性谱系Nlrp6-/-小鼠的研究表明，Nlrp6缺失可以异常调节炎症复合体的信号进而允许机会致病菌和促进引起结肠炎的细菌（例如普氏菌属）的生长。然而，最近有3项研究挑战Nlrp6在正常肠道微生物群落下调节肠道生态系统的这一观点。总的来说，Nlrp6对Nlrp6-/-和野生型小鼠的肠道微生物群落没有明显的影响。此外，对无菌（GF）小鼠进行相同的粪菌移植并且收集粪便进行测序发现肠道微生物群落结构在不同基因型的小鼠中没有明显区别。 总体来说，对微生物群落采用控制变量法研究后表明体内平衡时免疫系统对肠道微生物群落的影响很小。即使缺少重要的功能基因，宿主的免疫系统和肠道微生物也可以维持一个健康的肠道环境。然而，增加采样准确度、增加微生物基因组测序深度和考虑采样空间和时间可能会揭示免疫反应对微生物群落的影响。我们期待更加深入的研究。 4. 免疫激活：炎症对微生物群落的影响 IBD的特点在于病原微生物在肠道微生物群落中的转变与慢性肠炎相关。IBD相关的生态失调在于微生物群落多样性降低和致病菌的生长，尤其是变形菌门。肠道微生物群落失调发生在炎症初始发生之前还是由于持续性炎症反应造成了肠道微生物群落失调仍然不是十分清楚。研究克罗恩病人的肠道微生物群落发现在治疗前后他们的肠道微生物群落发生了明显变化，有3个相关研究发现克罗恩病人的兄弟姐妹中检测到了肠道微生物群落失衡但没有炎症反应。然后这些发现由于实验模型缺乏足够的分辨率来形成新的诊断和治疗而没有被证实。 从另一角度来看，通过环境刺激或病原体诱导炎症可以导致肠道微生物群落结构发生动态变化，反映出相关的宿主环境变化和调节一部分是由肠道免疫反应介导的。炎症初始会通过释放抗菌物质而强烈改变肠道生态，抗菌物质创造一个不利的环境进而改变肠道微生物群落。 在小鼠中，急性炎症期间肠道微生物群落的变化类似于IBD相关的菌群失调。通常，拟杆菌门和厚壁菌门中的物种丰度减少，相对于健康机体，肠杆菌科中的细菌的丰度增高。转录组测序（RNA-seq）分析发现微生物群落基因表达主要涉及碳水化合物代谢先关的基因。最近的报道表明炎症反应会使小鼠模型中产生丁酸的微生物减少。炎症环境是影响肠道微生物群落结构的主要因素，肠道微生物群落也可能受免疫系统的间接控制。 5. 对疾病表型的影响：致病菌 在小鼠模型中，基因对免疫表型的贡献有时需要特定的环境因素或特性微生物参与。一种特定的致病有机体可能对免疫表型产生明显的影响。最近的研究支持了这一观点，其中原生动物鼠三毛滴虫的存在对粘膜免疫及肠道炎症反应的造成了显著影响。 目前，描述细菌性致病有机体的研究很少。例如，节丝状菌（SFB）会通过诱导产生大量的促炎性细胞因子Th1、Th17和调节T细胞来刺激粘膜免疫系统。在健康宿主没有明显疾病的情况下，致病菌和微生物群体可以共存，但在某些情况下，例如炎症刺激，这些微生物可能会由于驱动自身免疫进而促进疾病发展。目前，我们还无法阐明致病有机体对基因型的影响，因此也限制了我们了解致病有机体如何影响疾病表型。 6. 展望未来--微生物群落模型 实验动物的肠道微生物群落受多种环境因素影响，这也引发了一个问题—实验的可重复性问题。解决这一问题的一个办法就是所有研究人员的使用通用的小鼠模型来研究肠道微生物群落，并且都用同一套微生物群落进行定植。然而，这是一种理想状态，实施起来有极大的难度，这需要研究人员用统一来源的无菌动物，在全世界范围内使用单一的动物饲料和笼子等。即便是最好的研究员可能都不足以支付这么高的费用。 一些研究人员选择有经过抗生素处理的或GF小鼠作为研究对象，以降低菌种和群落水平与宿主相互作用的复杂性。通过使用移植一种或几种微生物群落的GF小鼠，已经证实了一些特定微生物群落与免疫细胞之间的关系。然而，这些研究都过于简单且随着微生物群落的复杂程度的升高而观察难度加大。建立不同配置的微生物群落模型，包括稀有的菌种已经成为可能，这得益于能够培养来源于肠道的厌氧细菌和广泛的应用GF小鼠。随着技术的发展，我们很快会对更多肠道微生物群落的功能有更深入的了解。 结语 目前，我们对肠道免疫系统的了解高于对肠道菌群的了解。是否采用控制变量研究宿主免疫对疾病模型中肠道微生物群落的影响至关重要。实验小鼠有明显区别于人的免疫学特征，这限制了我们将小鼠研究得出的结论直接应用于人类疾病方面。然而，随着技术的发展，我们可能在未来几年达到前所未有的进步。关于免疫系统和肠道微生物群落如何相互作用机制的研究需要新技术的发展。这些新技术将开启阐述疾病机制的大门，并有希望开发出治疗和诊断IBD和其他炎症疾病的新方法。
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