没有抗体也能做western blot，而且速度很快！

报告中说，

Promega公司宣布，它已与麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所签署了一项非独家许可协议，可销售CRISPR-Cas9基因编辑的工具和试剂，为研究人员探索生物学提供了新工具。
根据这项协议，Promega计划将Broad研究所的CRISPR-Cas9技术与自家的产品结合起来，将报告基因敲入任何细胞或细胞系的基因组中。他们的目标是让研究人员能够在生理学相关的表达水平上探索生物学。

处于好奇，我检索了以下，发现Promega想要借助CRISPR-Cas9技术敲入的报告基因是Hibit，而且在2017年有文章发表。

所以，本次文献阅读就从这里开始。

在2012年，Promega科学家改造了深海虾的体内的荧光素酶nanoluc，

这个酶比之前的萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶都要小。

小归小，但是他的活性是萤火虫和海肾的100倍，灵敏度也十分高，检测范围跨越7个数量级，他们找到的反应底物是Furimazine：

基于这个新的荧光素酶，promega更新了他们的产品线。

回到本文的题目，假如我研究的蛋白表达量比较低而且没有什么可靠的抗体怎么办呢？比如，你发现了一个新的蛋白，但是丰度不高。

第一种方法就是，尝试去做抗体，这个需要财力和运气。
第二种方法就是，使用基因编辑技术把一个tag标签蛋白接在内源性基因的后面，通过这个检测这个tag标签来实现检测基因表达的目的。

我们很容易想到，标签可以用绿色荧光蛋白GFP，这可是获得了诺贝尔奖的。

让人生气的是，在科学研究中，几乎每一个你拍案叫绝的idea都有人在你之前尝试了。在2015年的NC上，有人把GFP定点插入到了基因组上，

但是，问题是，GFP有27Kda，对于一些小蛋白来说，就是庞然大物，想想一个10kDa的蛋白身上接着一个27Kda的GFP，如何施展拳脚。那就把它切开啊，变成大小亚基，把小的接在基因上就可以啦，对的，有人已经想到了，很绝望是不是，世上聪明人多了去了，每次我提出一个idea并且告诉老板没有人做过时，老板总会说

果子哥，你要明确一下，是你傻还是问题傻，有可能是别人做了你不知道，或者是别人做了发现不可行。

所以，我很谨慎。

他们把GFP切成两半，一半是GFP1-10，一半是GFP11，后者只有16个氨基酸，必须两个碰在一起才能发光。

但是本文的作者说，他那个系统有问题：

• 1.GFP的检测的灵敏度差，内源性蛋白，以及信号通路的蛋白，往往表达不高，所以GFP反映不出他们的表达。

• 2.GFP从表达到成熟能够被检测有点复杂，时间比较长，不能反应及时的变化，不能检测出分子动态的检测水平。

这个是在前言说的，我很喜欢看前言，那个是产生idea的地方，作者此时话头一转，说，我们的深海虾的Nanoluc灵敏度特别强，只要你在，我就能检测到你，正好可以弥补这个系统的缺陷。此时，作者承认，这个idea来自于别人，

做不到人无我有，就实现人有我优。

接下来他们就开发了NaboBit技术

他们把这个nanoluc蛋白从156和157氨基酸之间切断，变成了大小两个亚基，此时他不发光了，但是合并在一起又可以发光。大的亚基叫large bit，小的亚基只有11个氨基酸，编码的蛋白只有1.3kDa。科学家对着11个氨基酸序列进行改造，又产生了两个不同亲和活性的基团，亲和活性小的叫smBit，用于研究蛋白相互作用，不是本次的重点，亲和活性高的那个叫Hibit，很小而且亲和性高，十分适合作为蛋白标签。本次就是讲的他。

如何实现tag的内源性嵌入呢？使用Crispr/cas9技术。

以GAPDH为例，简要步骤如下

设计crRNA

要获取GAPDH的基因组序列，我们本次要把tag加载GAPDH的末尾

其中crRNA的设计有很多网站可以做

cas9的切割位点在pam序列前三个，这个切割位点需要在非翻译区，最好切割位点能在插入位点的40nt之内。

设计修复模板

cas9切割基因组后，我们需要给他提供一个修复的模板

这个就是修复模板的设计，两边要有50-80nt的同源臂，中间的HiBiT序列需要promega授权获取。
打开这个网址
http://www./HiBiT-synthesis
阅读一下，他说这个序列不能商用，只能配合promega的产品使用，而且你不能截取其中的部分序列私自使用。同意之后，序列会发到邮箱。
如果有同学这么做了，一定要注意，这是商业公司，你签署了这个协议就要遵守，要不然被发现了，promega公司会起诉你的学校，赔偿上亿。

准备 ribonucleoprotein (RNP) complex

这一步很简单，其中tracrRNA ，cas9都是从IDT公司购买的成品，官网也是这么推荐的。

转入细胞

官网推荐使用电转，把这个复合体导入细胞。但是用化学转染也是可以的。

检测

24-48小时就可以检测，配合promega的产品可以自由检测蛋白。
可以像检测荧光素酶一样检测细胞中蛋白的表达：

也可以实现活细胞的检测

甚至可以实现不要抗体做western，转模之后直接显影。

宣传手册中还比较了和elisa的区别

综合来说，这个方法的特点就是，方便快捷。

• 方便体现在，他用crispr/cas9, 但是她全程没有用到分子克隆，因为这个Hibit 蛋白足够小，修复模板不需要用质粒来提供，直接合成，其中cas9蛋白直接购买IDT公司的成品，这意味着，每一个科研团队都有能力去尝试。这也解释了本文开头的那个报道，他为什么要和Broad研究所合作获得CRISPR授权，把cas9整合在这个产品中一起出售，用户使用起来更加方便，可重复性更高。

• 快捷体现在，因为这个Hibit灵敏度很高，crispr/cas9之后，不需要筛选单克隆细胞株，直接基因编辑后24-48小时就可以检测结果。大概有20%的细胞会被编辑，并且这个效率传代后也能保持很多代。
  

  

假如你预测某个非编码RNA能够编码，如何实验证明呢？

传统的方法是，针对ORF自己做抗体，必须在细胞内检测到才能说明问题。但是困境时，抗体不好做，即使有抗体蛋白表达量很低也无法检测。那么这个方法在2天内就可以解决这个问题。
这真是研究低表达基因的好帮手。

假如我们掌握了这个方法，还能这么用呢？

我可以把flag标签接在目的蛋白后面，这样，即使没有IP级别的抗体，也能实现内源性的Co-IP，这样高师姐的那一些列CO-IP的帖子又可以用起来了。不过，这时候，需要筛选稳定株，就是耗点力气而已。

此外，虽然这个方法不需要分子克隆，但是，掌握分析克隆才能自由地探索。

好了，这就是我们第1次的文献阅读。下次见。