关于RNA修饰核苷LC-MS定量分析，你不得不注意的几个问题

贺玖明 2019-02-19

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引言

RNA修饰核苷基本结构

RNA核苷主要有腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷4种。其结构如图1。RNA修饰核苷是以上4种基本核苷的碱基或五碳糖上被不同的化学基团修饰后产生的核苷。不同的化学修饰基团以及不同的修饰位点带来了修饰核苷种类的复杂性和多样性。关于171种已报道的RNA修饰核苷的结构，大家可以在Modomics 数据库在线查看。

图1. 4种基本的RNA核苷结构图

RMBase V2.0 数据库从涉及13个物种的47个研究中分析了566个数据集和1 397 244个修饰位点，从而统计得到了下表几种常见的RNA修饰核苷。其中最多的为m6A。想必大家也曾经都被报道m6A的paper刷爆过朋友圈。

RNA修饰核苷质谱裂解

RNA修饰核苷在正负离子模式下都有质谱响应，正离子模式下的信号通常强于负离子模式。以腺嘌呤核苷(A)在正离子模式下的质谱行为为例介绍RNA修饰核苷主要的质谱裂解规律。从图2可以看到，RNA修饰核苷的主要的裂解方式为糖苷键的断裂，断裂后产生一部分的带电碱基基团和另一部分的五碳糖的中性丢失。未被修饰核糖的中性丢失为132Da，当核糖被甲基修饰后，可产生146Da的特征中性丢失。根据修饰核苷的这两个特殊的中性丢失可利用132和146Da的中性丢失扫描对其进行定性研究。

图2. 腺嘌呤核苷(A)在正离子模式下的质谱裂解方式

当然并不是所有的修饰核苷都是以糖苷键断裂的方式形成它的子离子。就有这么一个特殊的修饰核苷跟其他修饰核苷的断裂方式不一样。这个特殊的存在就是假尿嘧啶核苷(Pseudouridine,简写为Ψ)。Ψ可能的质谱裂解见下图3。它在正离子模式下的特征子离子为125Da。

图3. 假尿嘧啶核苷(Ψ)在正离子模式下可能的质谱裂解方式

RNA修饰核苷LC-MS定量

根据part 3中介绍的RNA修饰核苷的质谱裂解规律，可以很容易得到其MRM离子通道。下表是几种常见修饰核苷的MRM离子通道。

从上表常见RNA修饰核苷的MRM离子通道可以看到。如果用MRM模式定量，A和I、C和U、Cm和Um以及m5C和m5U这四对通道是存在相互干扰的。因为在MRM模式下质谱的分辨率通常为±0.5Da(也就是通常说的Unit模式)，上述四对通道的Q1和Q2仅相差1Da，所以如果不在色谱上将其分离，进入质谱后其MRM通道必会互相干扰，导致定量结果出现问题。这个问题需要引起大家的注意。当然对于MRM通道完全一样的m1A、m2A、m6A和m1G、m7G也是必须要在色谱上达到规定的分离度才能保证其定量结果的准确性。

关于各个RNA修饰核苷MRM通道的电压和碰撞能量等参数，这里将不再介绍，因为大家所用仪器型号不同，其参数也会不一样。没有统一的标准。作者所用的仪器是Sciex 6500和Agilent 6490，有需要的可以联系我。下面再简单说以下RNA修饰核苷的分离色谱柱选择。

文献上报道的适合分离RNA修饰核苷分离的色谱柱主要为有极性封端的反向C18柱，如Hypersil GOLD aQ 柱(Thermo)，Synergi Fusion 柱（Phenomenex）等。作者本人在实验过程所选用的色谱柱为Hilic色谱柱。

20种常见RNA修饰核苷绝对定量

讲了这么多，也是时候展示作者自己的RNA修饰核苷定量方法了，该方法在6min时间内完成了20种常见RNA修饰核苷的分离。其保留时间、检测限、定量限定量范围等见下表。该方法A和I、C和U、Cm和Um以及m5C和m5U这四对存在相互干扰的通道都得到了明显分离。m1A、m2A、m6A和m1G、m7G也都达到了定量分离度的要求。