|
最早发现的 RNA 甲基化修饰包括假尿苷和 5mC 等。在 mRNA 中，常见的修饰包括 m6A、m1A、5mC 等。 听说有3种RNA甲基化修饰大热，他们是谁？ RNA甲基化修饰类型很多，目前最热门的有三种，分别是：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化。 图： 3种热门RNA甲基化修饰 1、m6A RNA甲基化 是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰，现在的研究主要是围绕各修饰的关键酶展开。何川教授在2017年1月的Nature Review（IF=46.602）上总结过m6A的相关修饰，由甲基转移酶复合体（METTL3、METTL14和WTAP组成）、去甲基酶（FTO和ALKBH5）以及相应的阅读器（YTHDF1/2/3，YTHDC1）协同调控。相关功能的研究证明了m6A修饰是动态可逆的，而且具有种类多样而又广泛的重要生物学意义。已发现的m6A RNA甲基化功能有很多，比如它可以促进环状RNA翻译(2017.3 Cell Res, IF 14.812)，或者通过促进mRNA降解来调控癌症干细胞的分化(2016.4 Cell Host Microbe, IF 9.661)，还能调控T细胞分化及免疫稳态(2017.8 Nature. IF 40.137)。 图：m6A RNA甲基化动态可逆修饰 2、m5C RNA甲基化是近年来发现一类在tRNA及rRNA高丰度存在的甲基化修饰。利用高通量测序手段验证了非编码RNA以及部分mRNA中m5C广泛存在，但是在不同物种、不同组织中m5C修饰分布图谱尚没有系统性报道。对于m5C来说，也有一系列的相关修饰酶(如下图)。m5C RNA甲基化功能，目前发现他可以调控mRNA出核(2017 Cell Res, IF 14.812)，或者调控干细胞蛋白质合成(2017 Nature, IF 40.137)。 图： m5C RNA甲基化动态可逆修饰 3、m1A RNA甲基化 是一个新进入大家的视野的RNA甲基化修饰类型。最近发表在Molecular Cell（IF：14.714）上的一篇关于m1A RNA甲基化的文章介绍到这是一类新型RNA修饰，它普遍存在于非编码RNA和mRNA中。m1A RNA甲基化功能，目前发现tRNA上发生多种m1A修饰(2017.2 Nucleic Acids Research， IF 9.28)，或者参与调控翻译起始和延伸(2016 Cell，IF 30.41)。总之，RNA甲基化也是调控基因表达的一种重要途径。 图：m1A RNA甲基化动态可逆修饰 早在上世纪 70 年代，人们已经在真核生物的 mRNA 和 lncRNA 中发现了 m6A 修饰。但是受到技术手段的限制，检测 m6A 尤其是对 m6A 进行定量，甚至是从单碱基水平鉴定 m6A，一直进展缓慢。随着高通量测序技术（next generation sequencing, NGS）的发展以及液相色谱灵敏度的提高，科学家们在此基础上发展了多种 m6A 检测方法。 很多人想做m6A的实验或者写m6A的本子时，基本功不扎实，不会写，我们看下2018年医学部m6A相关的几项基金情况，共有50项，所以2020年要申请的同学也要时刻准备基本知识了，科研喵五一给大家整理了一些，如下。 目前检测 m6A 所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LCMS），具体方法包括 MeRIP-seq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS 等。下面就来 介绍目前较为主流的四种检测 m6A 的方法。 1．C-MS/MS 图 1 LC-MS/MS 检测 RNA 中 m6A 水平分析流程图 如图 1 所示，第一步使用 TRIzol 提取完 Total RNA 后，既可以用 oligodT 磁珠对 mRNA 进行富集，也可以使用 rRNA 去除试剂盒获得包括 mRNA、lncRNA 等在内的 RNA。第二步使用核酸酶 P1（Nuclease P1）将 RNA 从单链 消化成单个碱基。第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色 谱仪，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量。第四步进入质谱串联分析，单个核 糖核苷酸会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根据出峰的保留时间计算 m6A 的面积。最后根据 m6A 和总腺嘌呤的比例就能算出 m6A 在 mRNA 上整体的甲基化 程度。 2．比色法 图 2 m6A 甲基化定量试剂盒流程展示及结果 比色法与 LC-MS/MS 比较相似，也是从整体水平上检测 RNA 上 m6A 甲基化水平。 相对于 LC-MS/MS 较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取 total RNA，也可以利用 oligodT 磁珠富集 mRNA。Epigentek 公司推出的这款名为 EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit 试剂盒其核心原理与 ELISA 反应类似，经过优化后检测 m6A 灵敏度会更高。 3．m6A-seq 图 3 MeRIP-seq（m6A-seq）与 miCLIP-seq 实验流程 如图 3 所示，第一步先对 mRNA 进行片段化，接下来使用带有 m6A 抗体的免疫磁珠 对发生 m6A 甲基化的 mRNA 片段进行富集，然后将富集到的 mRNA 片段纯化后构建高 通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将 2 个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到 m6A 甲基化程度较高的区域，也叫做 m6A peak。 这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的 mRNA 区域进行一个定 性分析。但是 MeRIP-seq 只能鉴定 m6A 高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨 率。送样要求建议为肝脏、脑等转录较为活跃的组织，如果细胞样本建议 1x109 的细胞量 （约为 8 板细胞以上）。最后总 RNA 含量推荐在 800ug 以上，mRNA 富集在 10-30ug 以上才会进入下游实验。 4．miCLIP-seq 已知 miCLIP-seq 等方法能够对 m6A 做到单碱基的分辨率。 如上图 3 所示，第一步依旧是对富集完的 mRNA 进行片段化。第二步，使用带有 m6A 抗体免疫磁珠与带有 m6A 的 mRNA 片段进行结合。第三步，使用紫外交联进行免 疫共沉淀后，在 mRNA 片段的 3’端连上接头序列，在 5’端加上 P32 放射性标记后进 行移膜。第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对 mRNA 片段进行反转录和纯化回 收。第五步，对反转录组的 cDNA 进行环化。第六步，对环化的 cDNA 进行复线性化， 然后构建测序文库上机测序。在这里采用 P32 放射性标记属于非必须选项。 科研可以是一种快乐 |
|
|
