【Nat Neurosci】一条有故事的X染色体

脆性X染色体综合征(Fragile X syndrome, FXS)，是导致智力障碍最常见的遗传性因素，也是自闭症的最高单基因致病因素，发病率仅次于21-三体综合征。致病原因是X染色体上Fmr1基因发生突变，导致维持脑部正常神经传导的脆性X智力低下蛋白（FMRP）制造量减少或缺乏。临床表现为智力低下、语言障碍、行为异常、发育迟缓、面容特殊等，并伴有孤独症、自闭症、癫痫等症状。一旦发病，无有效治疗手段，给家庭带来沉重的心理和经济负担。

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2019年2月11日，《Nature Neuroscience》刊登了威斯康星大学麦迪逊分校Zhao Xinyu团队的最新研究工作[1]，他们发现了线粒体融合可以改善FMRP缺失导致的神经元发育受损，Htt可以介导FMRP调控线粒体融合和树突成熟，提示了FMRP和HTT在FXS发病机制中的相互作用，提高了人们对该领域的认知。

Zhao Xinyu 图片来源：

University of Wisconsin-Madison

结果

1、FMRP对神经细胞的成熟过程至关重要

首先，作者通过DCX-Cre^ERT2鼠（DCX启动子诱导表达Cre酶）、TdT reporter鼠（Cre依赖表达tdTomato红色荧光蛋白的report鼠）以及Fmr1^loxp/+鼠杂交获得cKO鼠（tamoxifen诱导条件性敲除FMRP鼠，图1a）。他们对6周龄的cKO鼠和对照鼠注射tamoxifen（TAM），并取注射后3d、7d、14d、28d、56d（对应于新生神经元发育的关键阶段）的组织进行分析[2]（图1b），发现TAM诱导Cre重组酶在DCX+细胞中表达，导致FMRP在DCX+细胞中的选择性缺失（图1d-e）。

随后，他们对海马齿状回颗粒下层（SGZ）的tdT+细胞数进行量化（图1c），结果发现，FMRP的选择性缺失，使未成熟神经元数量在最初阶段有一个短暂的增加，而在发育成熟的最后阶段则显著性减少，最终导致新成熟神经元数量减少（图1f-m）。

图1 FMRP选择性缺失影响神经元的发育过程

接下来，作者在FMRP-cKO鼠（Fmr1^loxp/y）和FMRP-cON鼠（Fmr1^loxp-Neo/y）[3]的DG区注射retro-pDcx-Cre和retro-flip-GFP混合病毒（图2a-c），结果发现，与WT鼠相比，注射后28天，cKO鼠的DCX+新生神经元树突复杂性、总长度、分支点及端点的数量显著降低；而在cON鼠中，由于FMRP恢复，改善了cON鼠的DCX+神经元树突形态的缺陷（图2d-h）。这提示了在DCX+新生神经元中FMRP的表达对树突成熟的重要性。

进一步，为了评估未成熟神经元中FMRP缺失对新生神经元突触传递的功能影响，他们在cKO鼠的DG区注射retro-hSyn-Cre-GFP病毒，4-5周后，记录GFP+神经元的诱发动作电位（AP）和微小自发性兴奋性突触后电流（mEPSCs），结果表明，未成熟神经元中FMRP的缺失会影响其接受兴奋性传递的能力（图2i-n）。这些结果提示了，FMRP在神经细胞成熟过程中的重要作用。

图2 未成熟神经元中FMRP缺失导致神经元发育受损

2、FMRP缺失影响代谢过程

为了研究FMRP调控新生神经元发育成熟的分子机制，作者将Fmr1-KO小鼠和Dcx-DsRed转基因鼠进行杂交[4]。用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离小鼠DG区中的DsRed+细胞后（图3a,b）。转录组学分析出了与代谢相关的差异基因（图3c,d）。神经代谢高度依赖线粒体功能[5]，作者的研究发现，从Fmr1-KO鼠分离的海马神经元中，参与线粒体功能的几个差异基因的表达水平发生了变化，为证明这种变化与FMRP缺失有关，他们检测了硝基酪氨酸水平发现，与对照组相比，cKO小鼠的tdT+神经元的硝基酪氨酸水平升高（图3e,f）。

随后，作者在Fmr1-KO鼠和WT鼠的DG区注射Retro-pCAG-mitoDsRed病毒来观察新生神经元中线粒体形态（图3g），结果发现，FMRP缺失的未成熟神经元中线粒体碎片较多（图3h,i）。这些结果提示了，未成熟神经元中FMRP表达缺失会显著影响代谢过程，这可能是由线粒体功能障碍引起的。

图3 FMRP缺失影响代谢过程

3、线粒体融合改善FMRP缺失神经元的成熟过程

接下来，科研人员用mitoDsRed和GFP转染从Fmr1-KO鼠分离出的神经元，结果发现，与WT相比，Fmr1-KO鼠神经元中线粒体的纵横比、膜电位均显著降低（图4a-d），这提示了FMRP缺失会损害小鼠神经元线粒体功能。

线粒体可以通过分裂或融合发生频繁的形态学变化[6]，因此他们假设FMRP缺失的神经元线粒体纵横比降低可能是由于裂变增加或融合减少导致的，随后作者用光电开关实验验证这一假设，即Fmr1-KO鼠神经元中线粒体融合减少（图4e-h）。

图4 FMRP缺失的未成熟神经元中线粒体融合受损

进一步，他们用M1（可促进线粒体融合，恢复线粒体管状网络结构）处理Fmr1-KO和WT鼠神经元，结果发现，线粒体融合的恢复显著改善了FMRP缺乏导致的树突成熟度受损现象（图5）。

图5 增强线粒体融合可改善FMRP缺陷的未成熟神经元

4、HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损

接下来，作者研究了FMRP调控线粒体融合的机制。他们从BioGRID数据库中找出最可能参与未成熟神经元线粒体FMRP调控的靶点基因-Htt，随后，评估了未成熟神经元中HTT蛋白表达、Htt mRNA表达水平，结果发现，与对照组相比，cKO鼠DG区中tdT+神经元的HTT免疫染色强度明显降低（图6a,b），此外，Fmr1-KO鼠DG区和原代海马神经元的Htt mRNA水平均显著性降低（图6c,d）。

进一步，作者用慢病毒介导的shRNA感染海马神经元，干扰Htt，发现病毒感染神经元HTT的mRNA水平和蛋白水平以及MFN2（线粒体融合蛋白2，介导线粒体外膜融合）和OPA1（视神经萎缩1，介导线粒体内膜融合）的mRNA水平和蛋白水平均显著降低（图6e-l），此外，HTT敲低的海马神经元的树突状复杂性、长度以及节点数量也显著降低（图6m-p）。这些数据提示了，未成熟神经元中HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损，这与FMRP缺失导致的发育神经元发育受损表型一致。

图6 HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损

5、HTT表达增强可改善FMRP缺失神经元的线粒体融合

为了检验Htt降低是否与FMRP缺失神经元中线粒体缺陷有关，作者利用CRISPR/dCas9技术进行内源基因转录激活[7]。他们将设计的十条sgRNA靶序列转染Neuro2A细胞，筛选出能使内源性Htt mRNA水平和HTT蛋白水平表达显著性增强的sgRNA（图7a,b）。随后科研人员用筛选出来的sgRNA和dCas9-V164感染Fmr1-KO和WT鼠原代海马神经，结果发现，KO和WT鼠神经元中HTT蛋白表达水平就显著升高，更重要的是，KO小鼠神经元中HTT水平恢复到WT的水平（图7d）。此外，内源性Htt基因的激活提高了Fmr1-KO鼠神经元中线粒体的纵横比、降低了硝基酪氨酸水平（图7d,f），并改善了神经元的树突复杂度（图8a-c）。提示了，HTT是FMRP调控线粒体功能和神经元成熟的核心。

图7 HTT表达增强可改善FMRP缺失神经元的线粒体融合

6、增强线粒体融合可改善Fmr1-KO小鼠行为缺陷

上述研究发现M1可以改善Fmr1-KO鼠神经元中线粒体形态（图4），接下来，作者利用旷场实验（图8e）、定位测试（图8f）以及社会新奇度测试（图8g）三种行为学检测进一步验证M1可以改善Fmr1-KO鼠的行为缺陷（图8d-g）。

最后，他们在成年WT小鼠的DG区注射慢病毒介导的shRNA敲除HTT，并在21天后进行行为学检测（图8h）。结果发现，HTT敲除小鼠表现出空间记忆和交往能力受损，而M1则可以改善这一现象（图8i-k）。这表明缺乏FMRP或HTT的小鼠行为缺陷可以通过一种促进线粒体融合的化合物来进行修复。

图8 增强线粒体融合可改善Fmr1-KO小鼠行为缺陷

结论

FXS是一种X连锁遗传病，是最常见的遗传性智力障碍疾病。近年来，人们对FXS的关注逐渐增加。本文借助于大量病毒标记，发现FMRP缺失神经元的发育过程受损，而线粒体融合改善这一现象。随后，使用CRISPR/dCas9技术靶向激活内源性Htt基因后，恢复了Fmr1-KO鼠神经元的线粒体融合以及树突成熟缺陷。最后行为学检测发现线粒体融合可以改善Fmr1-KO鼠的行为缺陷。为FXS的治疗提供了理论依据。

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参考文献：

[1]Xinyu Zhao et al. Reduced mitochondrial fusion and Huntingtin levels contribute to impaired dendritic maturation and behavioral deficits in Fmr1-mutant mice. Nat Neurosci.(2019).

[2]Kempermann, G., Song, H. & Gage, F. H. Neurogenesis in the AdultHippocampus. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a018812 (2015).

[3]Guo, W. et al. Ablation of Fmrp in adult neural stem cells disrupts hippocampus-dependent learning. Nat. Med. 17, 559–565 (2011).

[4]Gao, Y. et al. Integrative single-cell transcriptomics reveals molecular networks defining neuronal maturation during postnatal neurogenesis. Cereb. Cortex 27, 2064–2077 (2017).

[5]Devine, M. J. & Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 19, 63–80 (2018).

[6]Schon, E. A. & Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron 70, 1033–1053 (2011).

[7]Konermann, S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517, 583–588 (2015).