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TDP-43是一个RNA结合蛋白，其异常的定位、聚集、翻译后修饰和降解是肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病的突出病理特征。TDP-43被报道可以发生液液相分离，但是其相分离的生理学功能与神经元功能的关系仍不清楚。2021年8月24日University of Nebraska Medical Center药理学和实验神经科学系的Xinglong Wang课题组在Journalof Cell Biology上发表了题为“Translational regulation in the brain by TDP-43 phase separation[1]”的文章，作者获得了表达内源性相分离缺陷的TDP-43的小鼠模型，研究揭示了TDP-43的液液相分离在脑功能调节中的特殊生理作用。 —TDPΔCR小鼠的行为学和神经元功能— 很多研究表明TDP-43 LCD上321到340AA的α-螺旋区域（CR）对于TDP-43的相分离具有重要影响。作者首先构建了外显子6编码的该结构缺失的突变小鼠（即TDPΔCR小鼠），新生的TDPΔCR小鼠与WT鼠相似，然而所有纯合子TDPΔCR小鼠出生后几小时内死亡，<20%的杂合子小鼠也在前2周因不明原因死亡（图1D）。除了体重略有下降，幸存的杂合TDPΔCR老鼠与同窝出生的WT在喂养和生存方面没有明显区别（图1E）。此外，定量分析发现，CR的缺失并没有导致TDP-43蛋白和mRNA水平的变化（图1F、G）。
图1 TDPΔCR小鼠的构建 接下来，作者采用一系列行为测试来评估杂合子TDPΔCR小鼠的行为学变化。成年或老年杂合子TDPΔCR小鼠的握力、旋转或运动活动没有异常，表明其运动功能未受干扰。然而，TDPΔCR小鼠在Nestlet-shredding测试和Marble-burying测试显示出明显的缺陷，表明重复的、强迫性的社交行为受损。尽管运动功能没有变化，杂合子TDPΔCR小鼠在光/暗探索任务中在光室中表现出极大的活动减少，暗示了杂合子TDPΔCR小鼠的明亮空间类焦虑行为增加。由于TDP-43与痴呆相关，所以作者进一步评估了TDPΔCR小鼠的认知功能。虽然TDPΔCR小鼠在新物体识别和恐惧条件反射测试中表现与对照组小鼠相似，但在Y迷宫和Barnes迷宫中表现明显下降，这表明其空间学习和记忆受损。综上所述，这些数据表明，TDP-43的CR缺失会导致大脑相关的行为缺陷。 以上描述的所有行为变化通常与海马活动有关。作者对TDPΔCR小鼠进行高尔基染色，分析海马神经元结构形态学，发现TDPΔCR小鼠海马CA1锥体神经元基底树突分支、长度和分支复杂性显著减少，表明树突分支受损，树突分支是与脑功能相关的神经网络形成的重要组成部分。同样，TDPΔCR小鼠海马CA1神经元的树突棘密度也显著下降。总体而言，TDPΔCR杂合小鼠与WT相比，神经元的组织学和生理学存在差异。验证了TDP-43 CR在脑功能调节中的重要作用。 ——TDPΔCR小鼠的相分离缺失—— 通过对TDPΔCR小鼠大脑神经元核内的TDP-43进行共聚焦成像，作者验证了其相分离能力的受损。TDPΔCR杂合小鼠神经元细胞核内的TDP-43液滴下降了40.5%，而在纯合子TDPΔCR小鼠的神经元中进一步下降到26.4%，表明TDPΔCR小鼠的TDP-43 相分离受损。
图2 CR缺失导致TDPΔCR小鼠中TDP-43相分离异常 接着，作者通过透射电镜分析了TDPΔCR小鼠大脑。发现TDPΔCR的海马组织显示出健康的神经元体细胞，然而有更高的核糖体密度（图3A）。考虑到核糖体密度与翻译速率之间的正相关关系，作者推测TDPΔCR小鼠的蛋白质合成率可能发生了变化。为了验证这一假设，作者采用基于嘌呤霉素与新合成蛋白结合的SUnSET技术来测量体内整体蛋白的合成（图3B）。值得注意的是，在TDPΔCR小鼠的大脑中嘌呤霉素结合多肽大幅增加（图3C）。这表明TDP-43CR的缺失促进了蛋白质合成。这些结果表明TDP-43相分离可能在翻译调控中具有普适作用。
图3 CR缺失小鼠的翻译异常 ——TDPΔCR小鼠的相分离缺失—— 接下来，作者在TDP-43敲除的HEK293细胞中表达TDP-43WT或TDP-43ΔCR突变体，通过质谱鉴定了细胞质中的相互作用蛋白。分别鉴定出18个和41个与胞质TDP-43WT和TDP-43ΔCR相关的蛋白，其中9个蛋白在TDP-43WT和TDP-43ΔCR沉淀样品中普遍富集，并主要与翻译相关。接着，作者对表达TDP-43WT或TDP-43ΔCR的HEK293细胞进行了coIP。TDP-43ΔCR与Poly(A)-Binding Protein Cytoplas4 （PABPC4）的共沉淀显著高于TDP-43WT，尽管在Input样本中PABPC4的水平保持不变（图4 F）。与野生型相比，TDPΔCR小鼠脑提取物中TDP-43共沉淀的内源性PABPC4含量也显著升高（图4 G）。值得注意的是，TDP-43同时共沉淀PABPC4、RPS6和RPL7。进一步暗示了TDP-43存在于由翻译相关因子组成的蛋白复合物中。
图4 CR缺失对翻译调控的影响 进一步，作者在TDP-43ΔCR中生成了一系列的缺失突变，发现删除99到105的7个残基（Δ99-105），完全抑制了TDP-43ΔCR或TDP-43WT共沉淀PABPC4和其他结合伙伴如RPS6和RPL7的能力。通过瞬转表达TDP-43ΔCR显著提高了蛋白质的合成率，而瞬转TDP-43ΔCRΔ99-105则不会。与此一致的是，转染TDP-43ΔCR引起的cap依赖和cap独立的翻译增加也被Δ99-105完全抑制（图5 K）。这些数据表明，TDP-43CR的丢失扰乱了其与翻译过程中涉及的各种翻译因子的联系。
图5 Δ99-105是TDP-43ΔCR翻译调控的关键 ——总结—— 综上所述，这篇文章通过构建内源性TDP-43缺失CR的小鼠模型，识别出TDP-43 相分离在调节蛋白质翻译方面可能意想不到的生理功能。这个新的TDP-43ΔCR小鼠模型显示了大脑相关的表型，包括社交、情感和认知障碍，但没有ALS相关的肌肉萎缩、运动缺陷和瘫痪，不仅有力地支持TDP-43 的相分离在维持脑功能中可能的重要作用，而且还暗示了与ALS无关的TDP-43在阿尔茨海默病和相关脑疾病中的发病机制。 参考文献： |
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