液态活检之cfDNA甲基化与断裂模式的研究及应用

在很早之前，研究人员就发现健康人血浆中的细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）分子是来自于造血系统的，有猜想表示，如果妊娠、器官移植、肿瘤等会释放与正常细胞不同的DNA分子到血浆中，那去检测这些与众不同的DNA分子是不是就可以实现无创检测和诊断呢？

果然在近几年，以血液作为主要材料的液体活检发展迅速，其中cfDNA（包含循环肿瘤DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞CTC、外泌体以及各种RNA等被广泛应用于无创产前、器官移植检测和肿瘤诊疗等领域。

图1. 液体活检的主要材料

通过对cfDNA的检测分析可以了解DNA含量、完整性、甲基化、基因变异等信息，例如：基因单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)、拷贝数变异(copy number variation, CNV)、结构变异(structure variation, SV)等。DNA甲基化作为表观遗传重要的一种表现形式，具有分布广、数量多、密度大等优点，且具有组织特异性，能在不改变DNA序列的前提下改变遗传表现。2016年，Nature子刊连发四篇新论文，预示了表观遗传分析用于临床诊断和精准医学的可行性。

那今天我们就为大家来介绍一下cfDNA甲基化与断裂模式在液态活检中的前沿研究及应用。

DNA甲基化简介与研究进展

DNA甲基化是一种共价修饰，主要是在胞嘧啶环第五号碳原子上加入一个甲基基团，即5-甲基胞嘧啶，简称5mC（5-methylcytosine），且主要是在CpG（CG序列密集区）的背景下发生。DNA甲基化是当下应用最广泛的表观遗传学生物标记，代表了一种注释遗传信息的复杂机制，尽管身体所有细胞的DNA序列都来源于一套遗传信息，但不同的甲基化模式对生理过程有着不同的影响并且可能遗传下去。

图2. 甲基化示意图

研究表明在妊娠和癌症模型中，cfDNA与其组织来源的基因组DNA的甲基化特征高度一致。在临床实践中，DNA甲基化信息可以从实体瘤或患者血浆cfDNA中提取出来，表1中概述了最近利用这种DNA生物标记物进行癌症检测的研究情况。考虑到肿瘤的高度异质性，图中也包含来自于正常人的组织生物标志物研究。

表1. 利用cfDNA进行检测的相关研究

其中，Liu等人使用靶向亚硫酸氢盐测序分析了cfDNA中选定的CpG位点用于癌症诊断，通过使用TCGA数据库中超过10000例的肿瘤样本数据，针对每个癌种，将数据分为training(80%)、testing（20%）sets，前者用于选出癌种特异的甲基化位点，后者用于验证；并在每个癌种中选出甲基化程度最高的3%的位点作为classifier；实际分类时，针对每个样本，分别计算不同癌种的特异性位点甲基化程度求取平均值，哪一个对应的CpG sites set甲基化程度的平均值最高，就将该样本归为该癌种，以利用甲基化信息实现组织溯源[16]。

DNA甲基化应用及问题

在肿瘤中，常在启动子区发现异常的DNA甲基化模式，即抑癌基因的高度甲基化和原癌基因的低甲基化。在不同类型的癌症患者血浆cfDNA中发现了大量基因的异常甲基化，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌和头颈部鳞状细胞癌。通过对这些异常甲基化进行分析，我们可以了解到肿瘤的分级分期、侵袭转移甚至生存期等相关信息[17]，另外，抑癌基因异常甲基化可以作为肿瘤表观遗传治疗的靶标。Chan等人的研究表明，可利用全基因组亚硫酸氢盐测序测定血浆cfDNA，可以作为诊断多种癌症的通用方法[18]。然而，由于肿瘤DNA含量较低，全基因组亚硫酸氢盐目前在早期癌症患者中仍难以敏感地检测到这种低甲基化信号。

图3. 甲基化影响转录水平

尽管越来越多的表观遗传生物标记物被用来诊断癌症，但如何确定具有足够临床准确性的生物标志物仍然是一个挑战。如表1所示，单个标记物或小panel的特异性较高，其敏感性通常不太理想。据Gai等人报道，肝组织和造血系统(背景DNA的主要来源)肝特异性生物标志物的DNA甲基化水平分别为50%和5%。血浆cfDNA中有大量来源的造血系统提供的cfDNA，所以大量甲基化背景DNA分子可能影响测定的敏感性，即可能是由于背景DNA的噪声所致。针对这个问题，最近的一些研究开发了复杂的统计算法和生物信息学策略，用于分析cfDNA表观遗传特征来提高敏感性。

Xu等人报道了使用高特异性的DNA甲基化生物标记物用于肝癌患者的诊断和预后监测（P＜0.001）。通过构建了诊断和预测的医学模型，利用这些生物标志物采用Logistic回归方法来提高准确性。使用该种方法在肝癌诊断的敏感性和特异性上优于甲胎蛋白(Alpha fetal protein, AFP)，AFP是目前唯一可用于肝癌检测和监测的血液检测方法，但其临床应用受到敏感性低的限制[15]。

图4. cd评分和AFP在肝癌诊断中的价值

Zhou和他的同事将血浆cfDNA模拟为肿瘤和正常组织DNA的混合物，然后使用概率模型预测肿瘤负荷和肿瘤类型。CancerLocator在模拟和实际数据方面优于两种已有的方法（SVM、RF），即使在血液肿瘤来源DNA的比例很低的情况下也是如此。详见下图，在早期肿瘤患者中，CancerLocator、RF、SVM的错误率分别为0.240、0.807、0.816[19]

图5. 三种方法对十组模拟数据的分类性能

cfDNA断裂模式研究及应用

除了DNA甲基化外，最近的研究表明cfDNA片段化特征逐渐成为NIPT和癌症液体活检的一个新的具有潜力的研究方向。随着研究的进展，大家逐渐发现cfDNA的片段化并不是完全随机的，而是有着一定的规律。这表明在液体活检中，cfDNA片段化特征可能包含着一定的临床信息。需要注意的是目前关于cfDNA片段化特征的研究大多基于测序技术，是因为测序技术可以明确每个cfDNA分子的边界和位置。近期的研究中发现，在肿瘤患者中，肿瘤来源的ctDNA要短于背景cfDNA，利用该特征，如果对cfDNA进行片段筛选，能提高检测的灵敏度[20]。Lam等人的研究中发现，利用肿瘤ctDNA来源的的片段大小特征进行筛选，可以提高鼻咽癌（NPC）早期筛查的效果[21]。

图6. 鼻咽癌患者和EBV DNA结果持续阳性的非鼻咽癌患者(红色曲线)和常染色体DNA(黑色曲线)的大小分布

然而，目前关于cfDNA断裂模式的研究，无论是从生物学基础上还是从临床应用上，都是相当初步的，而且大多数研究仍处于原理的验证阶段。鉴于cfDNA片段化特征在NIPT中的广泛应用，将cfDNA片段化特征纳入今后的肿瘤液体活检研究同样具有重要的临床意义。

以DNA甲基化为基础的表观遗传生物标记物，和以cfDNA断裂模式为切入点进行分析，对原发灶不明的转移肿瘤组织溯源具有重要意义。原发肿瘤的生物学特征很大程度上决定了转移癌患者的预后情况，因此明确肿瘤来源对于确定治疗方案以及改善预后意义重大，我们期待研究的进一步深入和快速转化，尽早为患者们带来福音 ！

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