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发表期刊：《Journal of Cellular Physiology》 发表时间：2019.2 影响因子：3.923合作单位：苏北人民医院 文章链接： https:///10.1002/jcp.28201 研究背景  多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性最常见的一种复杂的内分泌紊乱疾病，以慢性无排卵或稀发排卵和高雄激素血症为特征，主要临床表现为月经失调、不孕、毛发生长和脱落、肥胖等。目前关于PCOS发病机制的研究不胜枚举，但因其复杂性和多因素性，至今还未阐明。有大量临床证据表明，多囊卵巢综合征患者罹患‐2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常和心血管异常的风险增加。 外泌体（exosome）是由大多数细胞分泌的具有双层膜结构的直径为40-100nm囊泡，包含细胞特异性蛋白、脂质和核酸，如DNA、mRNAs、miRNAs和lncRNAs等。外泌体作为一种信号分子，可以传递给其他细胞以改变其功能。 近几年，环状RNA（circRNA）的研究炙手可热，它的功能也越多被挖掘，有越来越多的证据表明，circRNA与其他非编码RNA类似，也参与基因表达和信号通路。然而，还没有研究表明circRNA是否也参与多囊卵巢综合征的发病机制。此研究立意能填上了这个空缺，为进一步深入研究PCOS发生发展的各种基因和途径提供了新的思路。 研究思路 材料与方法 本研究所用到样品均是严格按照Rotterdam诊断标准筛选的原发性不孕症患者。（TABLE1） 实验组为3例PCOS患者，对照组为3例Non-PCOS患者。所有患者统一给予促排卵治疗，注射hCG(2000U)36h后，采集卵泡直径大于15mm的卵泡液。 上面提到外泌体中包含细胞特异性蛋白、脂质和核酸，因此先从卵泡液中分离出外泌体，再从外泌体中提取Total RNA效率会高些。 这里主要详细介绍一下外泌体提取的方法步骤： 1.将收集的卵泡液样本(约15ml)在1,500g，室温下离心15min，留上层清液，可储存在−80℃备用；(去细胞碎片等杂质) 2.将上层清液2,000g，4℃离心30min，留上层清液；（为得到外泌体） 3.上清液过30KD滤膜浓缩，10,000g，4℃离心30min，留下上面截留液；(滤膜孔径一定要小于外泌体直径) 4.加0.2倍体积Total exosome isolation reagent，室温孵育30min，10,000g，4℃离心30min，留沉淀；(沉淀即为外泌体) 5.用1xPS重悬沉淀，使其终体积为浓缩后体积的1/4。(外泌体重悬液即可提取Total RNA) 研究结果 01 PCOS组共鉴定到12,907个circRNAs，Non-PCOS组共鉴定到5,972个circRNAs，这些circRNAs长度集中在200bp-1,000bp，RPM值集中在10-1,000且PCOS组比Non-PCOS组RPM值高，两组染色体分布呈现高度相似性。 (a).circRNA长度统计;(b). 表达量统计;(c).外显子数量统计;(d)circRNA在染色体上的分布 02 对两组间circRNAs进行表达差异分析，PCOS组中有167个上调基因，259个下调基因。各筛选出差异倍数最高的前5个基因。其中的RHOA、BECN1、TIAM1、RUVBL1基因已被报道参与PCOS发病机制。 (a). 差异circRNA热图；(b).火山图；(c).统计的差异倍数最高的前5个（红色为上调，绿色为下调） 03 利用GO分析（这里用的ClueGO，具体方法可参考之前的推文：干货 | GO富集分析工具汇总）和KEGG分析（WebGestalt）对差异circRNA靶基因的功能富集分析。这些靶基因在细菌感染、氧化应激和自噬相关的病理过程中发挥了作用，暗示了PCOS发病机制的更多因素。 (a). GO分析；(b).KEGG pathway分析（气泡图）. 04 对筛选出差异倍数最高的前5个基因做qPCR验证，除了ciRNA‐785_RELA外，qRT - PCR检测的所有环状RNA的表达趋势与RNA测序结果一致。 双坐标轴图（左侧是测序数据，右侧是定量PCR数据）,采用的GraphPad prism（有机会出一篇怎么做双y轴图的文章）. 05 使用Cytoscape（Cytoscape使用方法，干货 | GO富集分析工具汇总这篇中也有介绍）构建circRNA‐miRNA相互作用网络，4个circRNAs和141miRNAs之间有161个相互通路。 红色圆形节点代表circ，绿色菱形代表miRNA，节点（node）的大小代表与mirna相互做用的miRNA的多少，连线的粗细代表circRNA-miRNA相互作用的评分. 研究意义 本研究通过鉴定PCOS外泌体中circRNAs的变化及与靶miRNAs之间互作关系的探索，为已发表的PCOS发病机制研究提供了有价值的补充，揭示了多种新circRNAs、miRNA和基因靶点，值得进一步研究。
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