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2019年2月22日/医麦客 eMedClub/--PD-1抗体药物是多种类型癌症的有效治疗方式。然而产生积极应答的人群只是其中一部分，仍然有部分人表现出疾病进展。这也体现出了在这些肿瘤中影响免疫应答的其他机制的重要性。 因此，增强抗肿瘤活性的联合疗法已成为整体肿瘤免疫领域的热点。这可以从以下数据得到反应——研究抗PD-1药物联合其他疗法以增强抗PD-1药物抗肿瘤反应的临床试验，已经从2009年只是作为一项新的尝试，飙升至2017年的1100项。 虽然这种增长表明以免疫为中心的治疗方法的火热，但也明显超过了可搜集的支撑临床前数据。此外，检查点抑制剂联合其他可能药物的疗法可能扩大可被招募进临床试验的患者数量，这可能需要较低的动力设计。总的来说，这些问题强调需要一种方法来确定适用于患者群体的基本治疗组合。 近日在Science Advances上发表的一篇研究论文就给出了一种答案。在该研究中，研究者们采用体内功能基因组学鉴定了抑制基因活性将增作用强抗PD-1免疫疗法反应的相关基因。结果发现靶向DDR2引起PD-1抑制剂的肿瘤免疫激活的增强。同时，证明了在不同类型的肿瘤的模型中，这种组合疗法的作用是稳定的，展示了较好的作为临床试验基础的临床前数据。 快速发展的癌症免疫疗法领域的重要进展，使用体内功能基因组学来鉴定其抑制作用增强对抗PD-1免疫疗法的反应的基因。具体而言，我们定义了一种新机制，其中靶向胶原受体DDR2（盘状结构域结构域受体2）引起对用PD-1抑制剂免疫检查点阻断的显着增强的反应。我们证明这种组合在代表不同癌症类型的多种肿瘤模型中是稳健的，并且呈现了作为正在进行的临床试验的合理基础的临床前数据。 鉴定最佳候选基因以增强抗对抗PD-1的反应 为了评估肿瘤对免疫活性动物抗PD-1治疗的反应，建立了一种来自化学诱导肿瘤的小鼠膀胱癌同源细胞系模型，其已知具有与人膀胱癌相似的分子特征。从N-丁基-N-（4-羟基丁基）亚硝胺（BBN）处理的C57BL / 6小鼠切下肿瘤，并适应体外细胞培养以产生NA13细胞系（图1A）。全基因组测序（WES）NA13揭示Trp53，Aird1a和EP300错义突变，这是在BBN诱导的小鼠膀胱肿瘤和人膀胱癌的数据集。 使用NA13，进行了基于体内短发夹RNA（shRNA）的选择药物靶标筛选，其中有美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物和鉴定的基因，其肿瘤的敲低能够加强对抗反应-PD-1免疫疗法。首先，将含有汇集的34个基因shRNA文库（每个基因5个shRNA）的NA13细胞皮下注射到同基因免疫活性小鼠中。为了鉴定其耗竭导致免疫激活抗PD-1介导的细胞死亡增加的候选基因，使用新一代测序对肿瘤样品中的shRNA构建体进行定量，然后优先在抗PD中丢失优先基因。 -1-处理组与免疫球蛋白G（IgG）处理组相比（图1B）。遵循既定方法，使用三种不同的方法确定优先损失：（i）每个基因的总shRNA的百分比具有减少的计数（图1C），（ii）基于平均倍数变化以第一和第二减少的shRNA对基因进行排序（图（1D），和（iii）在文库中顶部15％最耗尽的shRNA中鉴定的每个基因的shRNA构建体的数量（图1E）。评估使用所确定的所有三种方法 DDR2，胶原蛋白受体，当被激活时，触发器包括SHP-2，SRC，和MAP（促分裂原活化蛋白）激酶，作为排名第一的基因。 DDR2的敲低使肿瘤细胞对抗PD-1疗法敏感 为了验证筛选结果，敲除了NA13细胞系中的DDR2，并在存在和不存在抗PD-1处理的情况下追踪肿瘤生长。通过定量聚合酶链反应（qPCR;图S1A）和免疫印迹（图2A）证实稳定的shRNA介导的DDR2敲低。DDR2消耗和抗PD-1治疗的组合在控制NA13肿瘤方面非常有效（图2B）。因为DDR2改变（过表达，扩增和突变）是已知的几种类型的癌症，以驱动更具侵略性的表型，测试使用乳腺癌，黑色素瘤和结肠癌细胞系我们的NA13结果的普遍性。确认了黑色素瘤细胞系B16F10中DDR2的敲低（图2C和图2。S1B）。小鼠的抗PD-1治疗仅在shDDR2 B16F10细胞中有效减少肺转移（图2，D至F）。观察到肺表面明显减少或消除可见肿瘤（图2，D和E）。在组织学评估后，用IgG处理的shControl和shDDR2肿瘤均表现出高肿瘤浸润，局灶性炎症和坏死区域以及支气管上皮的丢失（图S2）。在肿瘤大小方面没有观察到视觉差异，表明肿瘤数量是观察到的肺部肿瘤负荷增加的原因。相反，携带用抗PD-1处理的shDDR2肿瘤的小鼠表现出最小的肿瘤负荷（图S2）。在乳腺肿瘤细胞系E0771中使用shDDR2进行单基因验证显示出类似的效果，其中DDR2的敲低（图2G和图S1C）使得肿瘤对抗PD-1治疗更敏感（图2，H和I）。 使用RNA测序（RNA-SEQ），然后基因组富集分析（GSEA）辨别基因和通路的差异（抗PD-1进行分析处理的shControl和shDDR2 NA13肿瘤）。该分析揭示了用抗PD-1处理的shDDR2肿瘤中的强免疫应答。与IgG治疗相比，免疫相关途径的上调对于用抗PD-1治疗的shDDR2肿瘤是特异性的；在用抗PD-1治疗的shControl肿瘤中未发现这种强烈的免疫应答（表S2）。我们还观察到具有多个T细胞受体信号传导途径的强T细胞特征，其在前一组中显着富集（图3A）。通过这些肿瘤的飞行时（CyTOF）分析的细胞计数显示CD8增加+ T细胞浸润到用抗PD-1处理的shDDR2肿瘤中（图3B），其在脾中未见（图S3）。在治疗组中，肿瘤浸润性T细胞的PD-1表达水平未观察到变化（图S4）。通过细胞和基因表达水平的分析的这些观察结果表明在用抗-PD-1处理shDDR2-或达沙替尼处理的肿瘤后存在强T细胞存在。 达沙替尼和抗PD-1联合疗法可增强肿瘤控制 DDR2是多种FDA批准的激酶抑制剂的靶标。Dasatinib是这些抑制剂中最有效的抑制剂，已在多项临床试验中进行了研究，包括激活DDR2突变的肺癌患者。为了进一步评估靶向DDR2的功效，测试了达沙替尼和抗PD-1的组合。尽管单独的PD-1或DDR2的治疗性阻断对NA13肿瘤几乎没有或没有影响，但用达沙替尼和抗PD-1的组合治疗显示肿瘤负荷的显着降低（图4A）。用MC38结肠癌模型（图4，B和C）和1956年肉瘤模型（图4D）观察到类似的结果。 肿瘤的免疫谱分析显示CD8 + T细胞的存在增强 接受达沙替尼和抗PD-1的小鼠中MC38肿瘤的CyTOF分析显示脾和肿瘤浸润性CD8 + T细胞均显着增加（图4，E和F，以及图S5）。因为达沙替尼和抗PD-1组合的这些发现反映了与shDDR2和抗PD-1组合中所见相似的模式，这表明肿瘤DDR2表达在介导该免疫应答中的直接作用（图3B）。当达沙替尼和抗PD-1处理增加肿瘤和脾脏中的CD8 + T细胞时，用抗PD-1处理shDDR2肿瘤仅导致肿瘤中CD8 + T细胞增加。在两种情况下，观察到CD8 +的增加T细胞是联合治疗所特有的，并且由于两种治疗方法提示对肿瘤抗原的特异性免疫应答。肿瘤微环境中CD8 + T细胞的存在和先前存在的肿瘤抗原特异性T细胞克隆的扩增也是关键的并且预测抗PD-1疗法的有利反应。 为了鉴定DDR2表达与人类肿瘤中推断的免疫浸润之间的关联，使用CIBERSORT方法和癌症基因组图谱（TCGA;图S6）的大量肿瘤RNA-seq数据估计免疫群体的相对丰度。低DDR2表达与增加的CD8关联+ T细胞和活化的树突细胞浸润（图4G。），这已被证明是更好的预测患者结果。这些发现支持了用shDDR2-和达沙替尼治疗的肿瘤的实验结果，PD-1阻断表现出CD8 + T细胞的增加（图4F））。具有低DDR2表达的人肿瘤也表现出降低的巨噬细胞水平（图4G），其存在已经显示出对抗PD-1的功效产生负面影响。这些发现表明，具有低DDR2表达的肿瘤的患者具有更有可能对抗PD-1治疗有利的肿瘤微环境。 “如果我们的研究结果在临床试验中得到证实，那意味着通过结合两种类型的药物，我们可以更好地缩小甚至消除膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，黑色素瘤和肉瘤。”通讯作者Cedars-Sinai Cancer主任Dan Theodorescu博士说。 参考出处： http://advances./content/5/2/eaav2437 中国肿瘤免疫治疗行业虽然在快速发展，但仍然面临诸多的挑战。2019年医麦客再次邀请数十位包括新药政策制定专家，技术与临床应用专家，新药研发企业代表汇集中国上海，计划于2019年3月23日至24日召开第二届肿瘤免疫治疗技术研讨会，与来自全国500+行业精英一起探讨肿瘤免疫治疗药物的技术革新与发展趋势。医麦客诚邀您参加中国·上海2019（第二届）肿瘤免疫治疗技术研讨会
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