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致力于提供专业的质谱多组学解决方案 大肠杆菌代谢的调节涉及多种机制，其中氨基酸生物合成的转录调控主要作用于酶的丰度，而变构反馈抑制主要作用于酶的活性，由于代谢反应速率是由酶的丰度和活性共同决定，因此很难区分两种机制在代谢中的具体作用以及相互作用。并且相关理论分析表明，变构反馈抑制在终产物稳态、代谢稳健和通量控制以及最优生长方面起着关键作用。 为了探讨变构反馈抑制在氨基酸生物合成中的作用，该研究运用CRISPR法构建了7个大肠杆菌氨基酸合成反馈失调突变体，通过蛋白质组和代谢组及代谢模型，结合理论和实验分析明确了在氨基酸生物合成中变构反馈抑制和酶丰度调节之间的相互作用。 1 文章题目 Allosteric Feedback Inhibition Enables Robust Amino Acid Biosynthesis in E. coli by Enforcing Enzyme Overabundance. 2 技术路线 3 研究结果 1、非靶向代谢组—反馈失调对代谢物的影响 利用LC-MS/MS对野生型和突变体大肠杆菌胞内代谢物进行了非靶向定量分析，发现仅有氨基酸的生物合成通路代谢变化显著，突变体中失调通路的氨基酸产物增加2至16倍，但其余的氨基酸浓度及代谢物的分布仍然相对稳定，表明在大肠杆菌氨基酸生物合成中，失调变构酶可提高相应氨基酸产物的胞内浓度。 2、蛋白质组—反馈失调对酶丰度的影响 基于Lable free定量蛋白质组学分析，共鉴定173种氨基酸代谢酶（大肠杆菌代谢模型中共204种氨基酸代谢酶），发现在七条反馈失调通路中，有五条通路中酶的丰度较低（argA*、 trpE*、 hisG*、leuA*和 thrA*），表明氨基酸浓度的升高导致了其相关通路的补偿性下调。除此之外，在argA*、trpE*和proB*突变体中，还发现了额外的补偿机制—氨基酸降解通路的酶丰度上调（AstC、TnaA和PutA）。 该研究还通过GFP-启动子融合的方法验证了蛋白质组学获得的数据，并发现argA*、trpE*和thrA*突变体中酶丰度下调的调控发生在转录水平。 3、生物合成通量分析—生物合成酶处于过剩状态 通过测定野生型和突变型大肠杆菌的生长和生物合成通量，发现除leuA* 突变体外，所有突变体均呈野生型生长。并且与野生型相比，反馈失调突变体的生物合成能力不受低酶水平的限制，生物合成通量相同或更高。表明这些酶在野生型大肠杆菌生长过程中处于过剩状态。 4、代谢模型—变构反馈抑制和酶水平调控的相互作用 为了更好地理解变构反馈抑制与酶水平调节之间的相互作用，该研究建立了代谢和酶表达的动力学模型。通过代谢模型进行验证，发现高酶水平的模型表现出更强的稳定性，而酶水平较低的模型对酶表达的扰动更敏感。但稳定性与酶水平不成比例，与酶水平的细微变化相比，较高的酶水平并没有显著提高稳定性。 随后该研究通过去除野生型大肠杆菌中酶水平较低的通路中的转录调控（精氨酸、色氨酸和组氨酸），发现酶水平提高，表明野生型大肠杆菌并未在精氨酸、色氨酸和组氨酸酶最大表达程度时生长，而是在两者调控的平衡状态。综合模型和失调突变体的研究，表明精氨酸、色氨酸和组氨酸通路之间存在着两种调控作用的调节性相互作用。 5、变构反馈抑制确保了基因表达扰动下的稳定性 通过构建基因表达扰动和3种氨基酸反馈失调突变的菌株，发现反馈失调突变体对基因表达的扰动更敏感，另外，这些突变体只对酶水平较低的通路内的扰动更敏感，并不缺乏一般的稳定性。因此，可以反向证明假说——高的酶水平会使精氨酸、组氨酸和色氨酸的生物合成对基因表达的扰动更加稳定。 4 结论 大肠杆菌氨基酸代谢中，酶活性和酶丰度的调节不是相互独立的，而是相互作用来控制代谢。 5 文章特色 本文结合蛋白质组、代谢组、生物合成通量分析、构建蛋白-代谢动力学模型等实验对提出的假说进行验证和推论，实验工作量大，数据可靠、说服力强。 一方面，由于代谢反应速率是由酶的丰度和酶的活性共同决定的，很难区分这两种调节的具体作用，本文通过巧妙的实验设计，区分开酶活性和酶丰度两个概念，一步步推论两者的相互作用关系。 另一方面，多组学数据为文章提供了强有力的实验证据。 最后，统计分析在假说的验证中也占据了非常重要的地位。 6 参考文献 Sander T，Farke N，Diehl C, et al.Allosteric Feedback Inhibition Enables Robust Amino Acid Biosynthesis in E. coli by Enforcing Enzyme Overabundance [J]. Cell Systems，2019，8(1)：66-75. 不好意思，打个小广告 北京博奥麦斯生物技术有限公司是一家专业从事蛋白质及代谢组学外包服务的公司。 我们拥有目前最先进的高分辨及高精度的质谱设备。研发团队在生命科学、农学及医学领域具有丰富的多组学研究经验，可提供专业的数据分析方案。 让我们共同努力，不断攻克生物领域的科学难题，为推动生命健康事业发展而奋斗。
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