|
生科云网址：https://www./ 编译：微科盟矫情的农民，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 实验设计
实验结果 我们从中国云南50个YHW株系中选择2个品系Dikemail(D，低籽粒蛋白质含量，GPC)和Yunmai0606 (Y，高GPC)进行分析。这两种小麦连续3年在保山(2019年)和寻甸(2020年和2021年)两种不同的环境下种植。在三年中，我们观察到两个品系的总GPC有显著差异(图1A)。在花后7 ~ 53 d（DPA），我们采集YHW籽粒，记录籽粒发育特征。在此期间，两个品系的籽粒含水率逐渐下降到53 DPA（花后天数）时的13%左右(图1B)。鲜重和干重逐渐增加，分别在42天和48天达到最大值，之后下降(图1C)。我们的结果表明，发育的籽粒分别在42和53 DPA时进入了蜡熟期(WG)和成熟期(MG)阶段。在这两个品系中，我们观察到从WG到MG阶段籽粒长度和宽度显著减少(图1D)。因此，我们分别选择42和53 DPA的两个YHW系的籽粒进行生理、代谢组学和转录组学分析。
我们在WG和MG期记录了D和Y穗和籽粒的表型。两个品系棕色粒色相似，在生理成熟过程中变化不大(图2A,B)。为了了解D和Y之间GPC的差异，我们测定了两品系WG和MG的总氨基酸含量(TAAC)，我们发现两品系之间以及两个发育阶段之间存在显著差异(图2C)。Yunmai成熟期（YMG）的TAAC是Dikemail成熟期（DMG）的1.3倍以上，我们证实了近红外分析测定的GPC差异。与MG相比，D和Y在WG阶段的TAAC显著增加，分别增加2.8倍和1.7倍，峰值为2.16
mg/g鲜重。为了阐明小麦籽粒生理成熟过程中氨基酸积累变化的分子机制，我们对样品进行了代谢组学和转录组学分析。
12个样品(Dikemail蜡熟期DWG、Dikemail成熟期DMG、Yunmai蜡熟期YWG和Yunmai成熟期YMG各3个)我们共鉴定出103种氨基酸（AAs）及其衍生物(AADCs)(表1)：必需氨基酸（EAAs）9种(8.74%)，其他AAs 15种(14.56%)，修饰AAs
73种(70.87%)，寡肽6种(5.83%)。我们利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行通路分析，对48种AADCs进行了注释(图3A)。主成分分析(PCA)显示四组(DWG,
DMG, YWG和YMG)之间存在明显的分离，PCA1和PCA2分别可以解释39.36%和25.04%的总方差(图3B)。同一品系内两个生育期(WG和MG)籽粒AADCs的差异大于两个生育期(Y和D)的差异。层次聚类分析(HCA)也划分了四组，包括两个主要类别和四个主要聚类(图3C)。第一类由68种AADCs组成，包括8种EAAs：亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）和甲硫氨酸（Met）。第二类包括35种AADCs，其中只有一个(色氨酸Trp)是EAA。AADCs的相对丰度在DWG、DMG、YWG和YMG之间存在显著差异。具体来说，在集群1中，DWG中AADCs的相对丰度最高，其次是集群2中的YWG，集群3中的YMG，集群4中的DMG，这也证实了TAAC和PCA分析的结果。此外，相关分析表明，相同样品的生物重复之间存在显著相关性(图3D)。我们的结果表明，D和Y籽粒的WG和MG具有不同的AADCs谱，表明了两种YHW在特定发育阶段AADCs的动态变化。 我们采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对小麦籽粒生理成熟过程中4组差异的影响因素进行分析。我们利用OPLS-DA对同一品系不同时期的AADCs含量以及同一时期不同品系之间的AADCs含量进行评估。我们比较结果为：DWG与DMG (R2X = 0.744, R2Y = 1, Q2 = 0.968)，YWG与YMG (R2X = 0.655, R2Y = 1, Q2 = 0.967)，DWG与YWG (R2X = 0.692, R2Y = 1, Q2 = 0.936)，DMG与YMG (R2X = 0.709, R2Y = 1, Q2 = 0.946)。各组的Q2值均超过0.93，说明模型很稳定。OPLS-DA评分图显示DWG、DMG、YWG和YMG明显成对分离，说明D和Y的WG和MG在AADCs代谢表型上存在显著差异。
4. 2个小麦品系在发育过程中AADCs的变化存在差异 我们共检测到24种常规氨基酸组分(CAACs)，包括9种必需氨基酸( EAAs )和15种非必需氨基酸( non-EAAs )。我们构建了描述DWG、DMG、YWG和YMG之间CAACs差异的热图和描述AA含量的雷达图。谷氨酸( Glu )、精氨酸( Arg )、天冬氨酸( Asp )、天冬酰胺( Asn )和色氨酸( Trp )含量最高，半胱氨酸( Cys )含量最低。虽然两个品系不同成熟阶段的常规氨基酸( CAAs )组成非常相似，但CAAs的丰度存在差异。9种EAAs (除Trp外，倍数变化为0.33或0.76)中有8种在WG (倍数变化从1.06到12.21)中的丰度高于MG。除Cys和Asn(变化倍数为0.58)外，DWG中非EAAs (倍数变化从1.19到2237.28)水平高于DMG。除脯氨酸(
Pro )、酪氨酸( Tyr )、Asn、谷氨酰胺( Gln )、Cys和Arg(倍数变化从0.51到0.94)外，其余非必需氨基酸(倍数变化从1.12到2.71)在YWG中的丰度均高于YMG。除Trp、Phe、Tyr、Asp和Cys (倍数变化从0.43到0.95)外，所有氨基酸在YMG中的含量均高于DMG，其中Lys、Met、Val、Leu、Ile、Thr和His (相对浓度为1.64 × 104 ~ 6.99 × 106)的丰度差异最大。从WG到MG大多数CAAs表现出下降趋势。Y中CAAs的丰度高于D，这种差异在MG阶段尤为明显。这些结果证实了GPC、TAAC和PCA分析的结果。此外，色氨酸代谢途径的代谢物含量在WG和MG阶段之间存在差异(图5B - E)。色胺和5-羟色胺酸是色氨酸转化为5-羟色胺的中间产物，WG的色胺和5-羟色胺水平低于MG。相反，血清素及其衍生物N -阿魏酰色胺在WG中的含量高于MG。 在DWG、DMG、YWG和YMG中，我们观察到58种AADCs的差异积累。K-均值分析将58种差异积累的AADCs ( DAAADCs )分为10个亚类，其中亚类1、2、3、4、6、8和10中DAAADCs的相对含量在两个小麦品系中从WG到MG阶段呈下降趋势。我们在DWG与DMG比较发现40种DAAADCs，其中4种(包括1种EAA - Trp)上调，36种(包括EAAs - Met、Val、Lys和Phe)下调(图6A , F)。在YWG和YMG之间鉴定的14种DAAADCs中，1种( Glu的还原形式)增加，而13种(包括丝氨酸( Ser )、Met、丙氨酸( Ala
)和同型半胱氨酸( Hcy )）从WG到MG阶段呈下降趋势(图6B , F)。我们的结果表明，DAAADCs的相对含量在两个YHW品系的WG和MG阶段之间存在显著差异，且在D中的差异大于Y。DWG和YWG之间的DAAADCs为26种，其中11种(包括Arg和Asn)上调表达，15种(所有AA衍生物)下调表达。在DMG和YMG鉴定的27种DAAADCs中，25种(包括Lys、Pro、高甲硫氨酸、鸟氨酸、His、Thr、Arg、Ser、高丝氨酸和Asn)增加，2种( EAA Trp和AA衍生物N -乙酰- L -色氨酸)减少(图6D , F)。这些结果表明Y中DAAADCs的相对水平高于D，并且这些差异在MG阶段尤为突出。此外，YMG的高GPC和TAAC可能归因于这些AADCs基因丰度的增加。在DWG和DMG、YWG和YMG之间有共同的12种DAAADCs，在DWG和YWG、DMG和YMG之间有共同的4种DAAADCs(图6E)，这说明籽粒中不同AADCs的相对丰度受籽粒生理成熟水平和基因型的影响。研究结果为小麦最佳采收期的确定提供了科学依据。
为了鉴定组间AAC（氨基酸含量）差异的潜在分子机制，我们构建了DWG、DMG、YWG和YMG 12个c DNA文库(每组3个生物学重复)。每个文库中93.56 %以上的碱基质量分数≥30，文库平均GC含量为58.50 %。经过质量过滤后，将reads比对到参考基因组上，不同文库的比对率在82.60 % ~ 95.55 %之间。我们总共鉴定出16961个表达基因和6896个未在参考基因组中注释的新转录本。相关性分析表明，各组内的生物学重复之间存在显著的相关性。主成分分析( PCA )显示DWG、DMG、YWG和YMG之间有明显的分离，可以解释总变异的43.76 %。RNA测序( RNA sequencing，RNA-Seq )数据质量较高，可靠性较好，可用于后续分析。为了鉴定不同生理成熟水平籽粒间的差异表达基因( DEGs )，我们将WG和MG的基因表达谱合并，并对不同组别进行两两比较。我们应用k-均值方法将所有28257个基因分为了10个不同的簇，这表明大量基因在不同组之间差异表达(图7A )。我们以| log2FC (倍数变化) |≥1和错误发现率(FDR ) < 0.05作为差异表达分析的阈值，在DWG和DMG之间我们共鉴定出14758个DEGs ( 6611上调，8147下调)，而在YWG和YMG之间共鉴定出9675个DEGs ( 3799上调，5876下调)。D和Y相比，在WG阶段有3617个基因上调，4182个基因下调；在MG阶段有2164个基因上调，2789个基因下调(图7B )。
为了研究DEGs的生物学功能，我们对不同比较组进行了基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析。结果表明，差异表达基因被分为41个功能组。在生物过程( BP )中，细胞过程( CP )和代谢过程( MP )是最突出的条目；解剖学实体主要富集在细胞组分中，分子功能（MF）中最具代表性的条目是结合和催化活性(图8A - D)。我们利用KEGG分析进一步确定DEGs参与的代谢通路，有4548个( DWG和DMG)、3046个( YWG和YMG)、2207个( DWG和YWG)和1386个( DMG和YMG) DEGs被注释到141、141、139和134个KEGG通路中，其中分别有34、32、28和28个显著富集( p < 0.05)。在不同比较组中显著富集的几个通路与AA分析的结果直接相关：Val、Leu和Ile降解( ko00280 )，Ala、Asp和Glu代谢( ko00250 )，AA生物合成( ko01230 ) (图8A - D)。此外，4个比较组的富集通路可进一步分为5类：细胞过程( CP )、环境信息处理( EIP )、遗传信息处理( GIP )、代谢( M )和生物体系统( OS )。在这些类别中，M包含的途径最多：代谢途径( ko01100 )、次生代谢物的生物合成( ko01110 )、AAs的生物合成( ko01230 )、碳代谢( ko01200 )、辅因子的生物合成( ko01240 )和淀粉和蔗糖代谢( ko00500 )途径。这六个通路在四个比较组中含量最丰富(图9A - D)。
KEGG途径和GO分析表明，许多DEGs编码了AA生物合成途径中涉及的关键酶和转录因子。这些结果佐证了本研究中观察到的YHW籽粒生理成熟过程中AADCs积累的差异。我们在D和Y中检测到与DAAADCs相关的415个DEGs，两组之间有396个DEGs ( 95 %以上)重叠(图10A )。在D中上调( 200个)和下调( 196个)的DEGs数量没有显著差异，而在Y中下调的DEGs数量( 206个 )略高于上调的DEGs数量( 190个 ) (图10B )。在DEGs中，235个DEGs在WG和MG之间表现出相同的趋势。在DEGs中，235个基因在两种基因型的WG和MG之间表现出相同的趋势；其中165个表达上调，170个表达下调。Venn图显示四个比较组中共有两个差异表达基因(图10C )。YMG中下调的DEGs数量高于上调的DEGs数量，且不同生理时期的同一株系内的DEGs数量显著高于同一时期不同株系间的DEGs数量(图10D )。上调和下调基因的表达模式与生理成熟期(从WG到MG)籽粒中AADCs相对丰度的变化趋势相似。我们在DWG和DMG中鉴定出247个DEGs，其中上调基因( 123个)和下调基因( 124个)的数量几乎相等。在差异表达基因中，210个为结构基因:201个编码结构蛋白，2个编码糖基转移酶，7个编码转录因子。DWG和DMG之间的DEGs上调或下调的程度相似。我们在Y和D中观察到的表达模式不同，在YWG和YMG之间鉴定到179个DEGs，下调基因(110个)的数量是上调基因(69个)的1.59倍。其中155个为结构基因：148个编码结构蛋白，2个编码糖基转移酶，5个编码转录因子。在YMG中上调基因的表达水平显著低于YWG。WG中AADCs的相对丰度高于MG。在DWG和YWG之间，我们发现了134个DEGs，上调基因( 61个)的数量是下调基因( 73个)的0.84倍。差异基因共包括100个结构基因，主要编码结构蛋白。在DMG和YMG，我们发现了82个DEGs，下调基因( 48个)的数量是上调基因( 34个)的1.41倍。这些DEGs包括58个结构基因，主要编码结构蛋白。虽然在WG阶段，D组的DEGs表达量高于Y组，但其表达量相对相似。此外，DWG中AADCs的相对丰度高于YWG。在MG阶段，D中上调的DEGs数量及其表达水平均高于Y。但在此阶段，Y中AADCs相对丰度高于D。
为了评估RNA - Seq数据的质量和确认基因的差异表达，我们使用qRT - PCR测定了12个与AA生物合成相关的基因在四组中的表达水平。这些基因包括编码烯醇化酶( PPH )的基因TraesCS3D02G331500，编码天冬酰胺合成酶( ASNS )的基因TraesCS5B02G131500，编码高丝氨酸脱氢酶( HSDH )的基因TraesCS5D02G181600，编码天冬氨酸半醛脱氢酶( ASADH )的基因TraesCS5D02G407800，编码支链氨基酸氨基转氨酶( BCAT )的基因TraesCS4D02G356200，编码乙酰乳酸合酶( ALS )的基因TraesCS6A02G218300，编码二氨基庚二酸转氨酶( DAPAT )的基因TraesCS3A02G310300、编码莽草酸激酶( SK )的基因TraesCS6A02G305400、编码预苯酸脱水酶( PDT )的基因TraesCS1D02G188500、编码色氨酸合成酶( TRPS )的基因TraesCS7A02G392800、编码丝氨酸O -乙酰转移酶( SAT )的基因TraesCS3D02G286900和编码谷氨酰胺合成酶( GS )的基因TraesCS4D02G047400。热图显示(图11A )，这些基因的表达水平在WG和MG中表现出明显的变化，如DWG和DMG、YWG和YMG，其中基因的差异倍数范围分别为0.19 ~ 11.49和0.18 ~ 8.06。编码SK、ASADH、GS、SAT和TRPS的5个基因在各比较组中的表达量均显著上调，而编码其他7个酶的基因在各比较组中的表达量均下调。其中，编码GS的基因TraesCS4D02G047400上调倍数最高，而编码PDT的基因TraesCS1D02G188500下调程度最高。这些基因表达量的变化与基因编码的酶所调控的相关代谢物含量的变化基本一致(图4 )。这些基因可用于进一步验证转录组数据的可靠性。利用qRT - PCR检测的大多数选定基因的表达变化与每个组的两个成熟阶段之间进行的RNA
- Seq数据分析结果相关(图11B )，表明转录组数据的高可靠性。
我们对D和Y 2个生理成熟期籽粒转录组进行WGCNA分析。我们将籽粒各发育阶段( WG和MG)AA代谢组数据进行组合，将DEGs分为18个模块，每个模块用不同的颜色表示(图12A
)。富集在同一模块中的基因在两个发育阶段表现出相似的表达模式。' MEturquoise '模块包含的富集基因数最多( 4431个 )，' MEgrey '模块包含的富集基因数最少( 1个 )。为了研究参与AA合成的基因簇，我们对不同基因簇(模块)与9个EAAs (性状)水平进行了相关性分析。模块-性状关联分析结果表明，' MEblue '模块中的基因与6个EAAs ( Val、Leu、Ile、Phe、Lys、Met ; r > 0.75)的水平呈显著正相关，而' MEmagenta '模块中的基因与Val、Leu、Ile和Phe ( r > 0.78)的丰度呈显著正相关。Lys水平与' MEgreen '、' MElightcyan '和' MEblue '模块( r > 0.6)中的基因呈显著正相关，而Trp丰度与' ME brown '、'
MEmidnightblue '和' MEsalmon '三个模块中的基因呈显著正相关(图12B )。此外，Trp与大多数基因模块的相关性与具有相同模块的其他8个EAAs的相关性相反。WGCNA分析的结果证明了AA生物合成相关基因与AAC之间关系的复杂性；模块与性状之间的相关性表明，色氨酸生物合成基因的调控与其他8个EAAs的调控之间存在显著的反向关系。
我们在D和Y的WG和MG阶段共检测到415个与DAAADCs积累相关的DEGs。我们利用相关聚类热图分析了217个差异结构基因与AA生物合成代谢途径中关键代谢物之间的关系。其中，48个基因与AA合成密切相关。我们绘制了这些基因的表达量热图(图13A )和AA生物合成途径中关键代谢物的丰度热图(图13B )。我们通过结合其他作物中已鉴定的AA合成途径的现有知识和对YHW在WG和MG阶段的转录组和代谢组数据的分析，提出了一条影响YHW籽粒生理成熟的AA生物合成途径(图13C )。基因表达水平热图揭示了不同YHW品种在不同生理成熟阶段中AA合成相关基因的不同表达模式，并将其分为4组(图13A )：第一组包括谷氨酸合成酶( GLTS )、ASADH、吡咯啉- 5
-羧酸还原酶( PC5R )、丝氨酸羟甲基转移酶( SHMT
)、苏氨酸脱水酶( TDH )、乙酰鸟氨酸转氨酶( NAOT
)、GS、异柠檬酸脱氢酶( IDH )、核糖-磷酸焦磷酸激酶( PRPP )、SAT和二氢脂酰胺脱氢酶( DLD )。这11种酶在WG中的表达量均低于二者在MG中的表达量。相比之下，第二组的29种酶在D和Y的WG中的累积表达水平高于MG。该组包括以下酶：2-异丙基苹果酸合成酶( IPMS )、磷酸甘油酸变位酶(
PGAM )、莽草酸脱氢酶( SDH )、ASNS、3-脱氢奎酸脱水酶 ( DHD )、PPH、阿罗酸脱水酶( ADT )、SK、TRPS、氨基酸N -乙酰转移酶( NAGT )、PDT、S -腺苷蛋氨酸合成酶( SAMS )、苏氨酸醛缩酶( TA )、阿罗酸脱氢酶( ADH )和赤霉酸异构酶( CM )，所有这些酶在DWG中的表达水平均高于其他组；还含有14种在YWG中相对于其他组表现出表达水平升高的酶：3-异丙基苹果酸脱氢酶( IPMD
)、ALS、苏氨酸合成酶( TS )、6-磷酸果糖激酶( PFK )、BCAT、吡咯啉- 5 -羧酸合成酶( PC5S )、同型半胱氨酸甲基转移酶( HMT )、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(
GDPDH )、HSDH、丙酮酸激酶( PK )、半胱氨酸合成酶( CYSS )、丙氨酸转氨酶( ALT )、DAPAT、乌头酸水合酶( ACO )。第三组包含5种在DMG中高表达的酶：3-脱氢奎尼酸合成酶( DHQS )、组氨醇脱氢酶( HDH )和精氨酸酶( ARGase )，以及在DWG和DMG中高表达的氨基甲酸酯合成酶( AS )和同型丝氨酸O-琥珀酰基转移酶( HST )。第四组包括3种酶：柠檬酸合酶(
CITS )、同型丝氨酸激酶( HSK
)和天冬氨酸转氨酶( AAT
)。其中，CITS在YMG中高表达，而HSK和AAT在YWG中表达量最高。YHW不同成熟期籽粒中不同氨基酸含量直接受基因表达水平差异的影响。AA热图显示，不同种类的AA积累水平在不同品系的WG和MG之间存在差异；除6种AAs (Trp、Cys、Pro、Arg、Gln和Asn)外，其他AAs在WG期的积累水平均高于MG期(图13B)。这一丰度反映了AAs生物合成和调控的复杂性。我们提出的AA生物合成途径为研究YHW不同生理成熟过程籽粒AA代谢产物和基因表达之间的复杂相互作用提供了新的见解，为研究YHW或相关物种中AA的生物合成提供了基础框架(图13C )。我们还对生理成熟过程籽粒中参与AA生物合成途径的415个DEGs的表达水平进行聚类分析，并使用热图进行可视化(图13D )。
EAAs对小麦的营养品质影响很大。为了加深我们对不同生理成熟过程中YHW籽粒中参与AA生物合成的调控网络和关键结构基因的理解，我们采用Pearson ' s相关分析研究了9个EAAs和48个结构基因之间的关系，使用Metware Cloud Platform生成高水平相关网络图，相关系数阈值为| r
|≥0.80且p < 0.05。我们的结果表明，在DWG和DMG之间，TraesCS2D02G280700
(编码PPH )的表达水平与其他8个基因呈显著正相关(图14A )。我们还绘制了除Trp外其他EAAs的高级相关网络图，其中TraesCS5B02G33100 (编码DHQS )的表达量与除Trp外的所有EAAs均呈显著正相关。TraesCS2A02G415800 (编码TA)、Traescs5D02G139300 (编码ASNS )、Traescs7A02G345600 (编码ADH )、TraesCS2A02G331700 (编码PFK )与Trp呈显著负相关，与其他EAAs呈显著正相关；TraesCS3B02G538100 (编码PC5R )、TraesCS3D02G266400 (编码GLTS )、TraesCS4D02G047500 （编码TDH )、TraesCS2A02G035700 (编码ARGase )、TraesCS3D02G175100 (编码IDH )与Trp呈显著正相关，与其他8种EAAs呈显著负相关。这些结果表明Trp的生物合成可能与多个基因的协同调控有关。同样，YWG和YMG的基因表达和AA丰度的相关性分析表明，AA生物合成基因之间可能存在协同或拮抗作用。Traescs1D02G188500 (编码PDT)和TraesCS3B02G538100 (编码PC5R )与除His外的8种EAAs高度相关，前者与Trp呈显著负相关，与其他EAAs呈显著正相关，后者则表现出相反的模式(图14B )。两组在WG和MG阶段的相关性分析显示，除His外基因表达与8个EAAs丰度之间存在较强的相关性，在这些基因中，TracesCS7A02G345600 (编码ADH )和TracesCS1B02G090600 (编码NAOT )的表达与Val、Leu、Ile和Met相关，前者与这4种氨基酸呈显著正相关，后者则呈相反趋势。Lys和Trp的丰度也与TraesCS3B02G006100
(编码IPMD )和TraesCS6A02G218300 (编码ALS )相关，而TraesCS2A02G331700 (编码PFK )与Lys呈显著正相关，与Trp呈显著负相关(图14C )。为了进一步鉴定参与YHW籽粒成熟过程中AA生物合成关键酶的编码基因，我们采用典型相关分析( CCA )分析了9个EAAs与生物合成途径基因之间的关系(图14D )。通过CCA实现的维度降低表明，9个EAAs分布在3个象限，并与12个基因的表达典型相关。在第一象限，Phe、Leu、Ile、Val和Met通常与ADT、GDPDH、ADH、ASNS、PPH、HMT、DHD和CM的表达相关。在第二象限，Trp与ARGase和DHQS的表达相关。在第三象限，Lys、Thr和His主要与ACO和IPMD的表达相关。这一分析强调了关键酶基因在YHW籽粒生理成熟过程中对AA生物合成起建设性作用。AA生物合成的复杂性涉及许多复杂的反应步骤，每个步骤都需要精确的精度。AAs通过糖酵解途径( EMP )、三羧酸循环( TCA )和磷酸戊糖途径( PPP )合成。由于Lys是第一限制性氨基酸，而Trp在DMG中含量最高，因此这些氨基酸可以作为改善小麦营养品质的研究重点。通过基因表达水平与EAAs的高水平关联网络分析，PPH、ADH、IPMD、DHQS和ARGase被确定为AA生物合成途径中的上游基因，直接参与AA的合成。这些基因在YHW籽粒生理成熟过程中作为AA生物合成的关键参与者而出现。
讨论 面包小麦籽粒因其营养成分含量较高，被用于各类保健品的开发。YHW是一个六倍体小麦品种，由于其品质好、蛋白质含量高，被认为是小麦育种的一个有价值的品种。然而，目前对黄淮冬麦区生理成熟期籽粒中氨基酸组成及其生物合成的分子机制尚不清楚。本研究我们以两个YHW品系Y (稳定的高GPC)和D (稳定的低GPC)为材料，通过整合转录组学和代谢物分析，揭示了生理成熟期YHW籽粒中的AA谱，并研究了其AA合成机制。本研究旨在筛选具有良好AA谱的云南YHW优质种质，分析小麦生理成熟发育阶段籽粒中AA的动态变化，并鉴定控制AA含量的候选基因和基因表达网络。该结果提高了我们对YHW籽粒中氨基酸组成的认识。明确了调控氨基酸合成的关键性状基因AA积累模式及其在WG和MG间的变化机制。同时，本研究也为不同灌浆时期小麦籽粒提供了参考，为进一步阐明WG期品质高于MG期的转录和代谢分子机制提供了框架。 蛋白质在改善籽粒品质方面具有重要作用，其含量被认为是反映籽粒营养品质的指标。氨基酸作为蛋白质的基本单位，介导细胞蛋白质的合成、生长、代谢和发育。在本研究中，我们在YHW生理成熟籽粒中共检测了103种AAs (包括衍生物)和24种常规氨基酸(均为L型)，包括19种主要氨基酸和9种人体不能合成的必需氨基酸，这9种被认为是小麦中的限制性必需氨基酸(图4 )。这些结果表明YHW籽粒富含氨基酸。人体中的AAC可以通过食用YHW籽粒来补充，WG阶段D系和Y系籽粒中的AAC显著高于MG阶段(图5 )。此外，D系MG的AACs低于Y系MG阶段。这些结果与生理生化指标的分析结果一致，表明2个YHW株系WG和MG籽粒中AA合成和代谢机制存在差异；然而，小麦中AAs的组成和含量受品种、小麦保护中使用的农药、营养、栽培环境和籽粒发育阶段等因素的影响。本研究中，Glu / Arg含量最高，Cys / Ala含量最低。在EAAs中，YHW株系生理成熟籽粒中Trp、Met和His含量相对较高。同时，Met、Trp和Phe 是D系WG阶段的前三位EAAs。His、Phe和Val是D系MG阶段的前3位EAAs，而Y系WG和MG阶段的前3位EAAs分别是Met、His、Trp和His、Thr、Phe。AAC分布热图显示只有Trp含量在MG阶段高于WG阶段，而Val、Thr、Leu、Ile、Lys、Met、His和Phe含量在MG阶段低于WG阶段。研究还表明，2个YHW株系生理成熟籽粒的AA组成虽然相同，但含量存在明显差异(图13 )。此外，在整个生理成熟过程中，YHW不同株系籽粒中的AA含量存在显著差异。不同阶段籽粒中色氨酸代谢物的差异积累可能是酶活性不同的结果。我们在D和Y系中也观察到类似的趋势，需要进一步的研究来确定这些趋势是否在不同的云南小麦基因型中保持一致。本研究首次描述了不同YHW系籽粒中氨基酸在生理成熟发育阶段的动态变化。 Lys、Thr、Met和Ile是小麦中限制性最强的EAAs。虽然构成蛋白质的常规氨基酸只有20种，其中9种必需氨基酸是人体营养和健康所必需的，但其他氨基酸如同型丝氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等在调节生长发育、维持细胞渗透压、清除ROS (活性氧)中的抗氧化剂等方面具有重要作用。D系WG期的Lys、Thr、Met和Ile含量分别是MG期的3.81、1.84、12.21和1.60倍。同理，Y系WG期Lys、Thr、Met和Ile分别是MG期的1.16、1.38、7.62和1.17倍。总体而言，MG阶段的同型丝氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量高于WG阶段。此外，虽然MG阶段色氨酸及其衍生物5-羟基色氨酸的含量高于WG阶段，但WG阶段血清素及其衍生物( N -阿魏酰色氨酸)的含量高于MG阶段。生理成熟期不同发育阶段各种Trp代谢物的积累可能是由于催化Trp进入不同代谢途径的酶不同。因此，不同YHW系蜡熟期籽粒的AA品质显著优于成熟期籽粒。这也首次从代谢物含量水平的角度揭示并验证了小麦生产中蜡熟期收获小麦品质高的原因。 差异积累AAs及其衍生物( DAAADCs )分析显示，在两个生理成熟期，D系中的DAAADCs均多于Y系，且两个YHW系中WG期的DAAADCs均显著高于MG期，包括不同AA代谢物的上调和下调(图6 )。这与DEGs结果(图10)一致。此外，热图显示，Ser、Met、Ala和同型半胱氨酸是两个YHW系在WG和MG阶段仅有的常规AAs；2个云南铁壳麦品系间DAAADCs也存在一定差异。这些结果表明，各种AAs的积累受品种和籽粒发育阶段的影响，表明控制籽粒AA积累的基因网络从根本上是复杂的，需要进一步阐明。深入分析小麦不同发育阶段籽粒AA组成和含量的变化及其分子调控，有助于小麦营养品质的提高和育种利用。 AA的生物合成受到碳和氮双重代谢的影响，从而产生复杂的调控途径。不同类型的AA合成利用Embden-Meyer 途径( EMP )、磷酸戊糖途径( PPP )和三羧酸( TCA )循环的中间体作为C链。籽粒中AA组成和含量的增加可能是由于蛋白质降解增加，糖酵解减少，相关含氮化合物的代谢活化，AAs的生物合成增加，以及糖酵解酶的表达增强，从而增加某些AAs的合成(如Glu，Asn Thr和Cys )。本研究基于代谢组和转录组数据，我们首次构建了YHW籽粒生理成熟和发育两个阶段的AA生物合成途径(图13 )。我们发现，在AA生物合成途径中的48个酶结构相关基因和23个AAs及其衍生物中，除TRAP和Trp、GLTS和Glu、SAT和O-乙酰丝氨酸、HDH和His、CYSS和Cys、ASNS和Asn外，大多数AA含量与其对应的合成酶结构相关基因的表达相关。我们推测这些代谢物的降解和下游转化可能会增强。我们还发现，参与EMP、TCA循环和PPP的大多数酶结构相关基因(PFK、PPH、PGAM、PK和ACO)的表达水平下降。与WG阶段相比，MG期YHW籽粒的EMP和TCA循环均下调，说明MG期籽粒AA含量的降低可能与碳水化合物代谢相关基因的表达减少有关。这是因为EMP - TCA循环是主要的能量来源，为植物生长发育所需的基础代谢产物的合成提供了碳骨架。 籽粒发育过程中AA含量和组成的动态变化，以及参与AA合成代谢的酶，特别是参与EAA生物合成的代谢酶，如赖氨酸生物合成的活性变化缺乏研究。代谢组学和转录组学的整合是研究AA生物合成机制的有效工具。WGCNA是系统生物学中的一个强大工具，可以作为一个关键的遗传网络来识别许多作物品质成分的生物合成。本研究基于2个不同生理成熟发育阶段的YHW株系、转录组DEG表达量(FPKM)和9个EAAs的代谢组数据，进行全基因组关联分析( WGCNA )，挖掘与AA合成相关的基因簇。WGCNA显示蓝色和红色模块与YHW中四个EAAs的含量呈显著正相关(图12)。这两个模块的基因在WG和MG期特异性表达，表明这两个模块在发育中的籽粒生理成熟中起重要作用。 基于编码主要酶的DEGs和9个EAAs的综合分析，我们构建了一个高水平关联网络图(图14 )。在YHW的D系中，PPH (由TraesCS2D02G280700编码)、ADH (由TraesCS7A02G345600编码)、ASNS (由TraesCS5D02G139300编码)、TA (由Traescs2A02G415800编码)、PFK(由TraesCS2A02G331700编码)、DhHQS(由Traescs5B02G33100编码)、PC5R (由TraesCS3B02G538100编码)、GLTS(由Traescs3D02G266400编码)、TDH(由TraesCS4D02G047500编码)、ARgase (由TraesCS2A02G035700编码)和IDH (由TraesCS3D02G175100编码)与9个EAAs含量显著相关，可能是该品系关键酶的候选编码基因。同样，PDT(由TraesCS1D02G188500编码)和PC5R(由TraesCS3B02G538100编码)与Y系中8个EAAs含量呈极显著正相关，被认为是该品系关键酶的候选编码基因。此外，ADH (由TracesCS7A02G345600编码)和NAOT (由TracesCS1B02G090600编码)均被鉴定为2个YHW株系关键酶的候选编码基因。此外，Lys和Trp与IPMD (由TraesCS3B02G006100编码)、ALS(由TraesCS6A02G218300编码)和PFK (由TraesCS2A02G331700编码)的表达显著相关。CCA还鉴定出ADT、GDPDH、ADH、ASNS、PPH、HMT、DHD、CM、ARGase、DHQS、ACO和IPMD在AA生物合成中起主要作用。总体而言，基因TraesCS2D02G280700、TraesCS7A02G345600、TraesCS3B02G006100、TraesCS5B02G33100和TraesCS2A02G035700被鉴定为YHW中对AA生物合成起主要作用的基因，这与已报道的在其他植物中起主要作用的酶编码基因相似而又不同，可能是由于植物种类和籽粒发育阶段的差异。 结论 YHW籽粒是富含氨基酸的小麦种质。在2个YHW株系中我们共检测到103种AAs及其衍生物。全部含有24种CAAs，其中9种为EAAs。虽然各株系的AA组成相似，但含量存在显著差异。D和Y籽粒在WG和MG期中分别有40种和16种差异代谢物。此外，籽粒中AAs的丰度随生理成熟而降低，WG阶段的AA含量高于MG阶段。两个YHW品系在MG期籽粒中Trp含量均高于WG期；在DMG中相对含量最高。其余8种EAAs在WG阶段的含量均高于MG阶段，Lys含量有限。D系和Y系的Met和Thr含量分别在WG期最高。转录组基因功能富集分析显示，415个DEGs与AA合成相关，生理成熟籽粒中与AA积累相关的基因表达模式与AA含量一致。我们通过对AA合成途径的差异表达结构基因和代谢物相关性进行聚类热图分析，比较鉴定出48个基因直接参与了两个YHW系籽粒在WG和MG阶段的AA合成。WGCNA和CCA结合代谢组学和转录组分析，揭示了YHW生理成熟籽粒中AA合成和差异积累的重要信息。结果表明，花生四烯酸生物合成途径上游的关键基因PPH、ADH、IPMD、DHQS和ARGase存在差异，或为花生四烯酸合成的直接关键基因。同源基因的不同表达模式也表明了AA合成过程中多个基因的协同作用。本研究提供了不同成熟期小麦籽粒的信息，为进一步阐明WG期比MG期具有更高的籽粒品质的转录和代谢的分子机制奠定了基础。
|
|
|
来自： 赵晓东ha626q9t > 《微生物植物互作》
