编译:木子依虫,编辑:十九、江舜尧。 原创微文,欢迎转发转载。 细菌通常产生抗微生物毒素以在微生物群落中取得竞争优势。本文利用表型,突变,生物信息学和宏基因组分析研究了由拟杆菌产生的拟杆菌毒素的广谱肽毒素家族。拟杆菌毒素与革兰氏阳性菌的IIa类细菌素有关,可拮抗拟杆菌门成员。其生物合成基因存在于水平获得的可移动元件中,其可在肠道微生物群内传播并且可以解释它们在人类群体中的广泛分布。拟杆菌毒素可以在微生物工程和多种微生物疾病如细菌性阴道病和牙周病的治疗剂中发挥潜在的应用。 论文ID 原名:A family of anti-Bacteroidales peptide toxins wide-spread in the human gut microbiota 译名:一类广泛存在于人体肠道的拟杆菌肽毒素 期刊:Nature Communications IF:11.878 发表时间:2019 通信作者:Laurie E. Comstock 通信作者单位:哈佛医学院 综述内容 1 产拟杆菌肽毒素的菌株 利用琼脂扩散实验,从15个物种的140株拟杆菌和副拟杆菌中筛选出了4株能产生毒素从而抑制拟杆菌和副拟杆菌生长的菌株(图1)。除去产生菌后残留在平板上的分泌毒素通常以不规则的模式沿着平板表面移动,当第二菌株以覆盖的形式加入平板时,这种现象导致抑菌圈发生偏移。 2 参与毒素产生的遗传区域 为了鉴定参与毒素产生的基因并确定四个菌株是否产生相同的分泌性毒素,使用菌株BoCL02T12CO4(BoCL02)进行随机转座子诱变。运用B. thetaiotaomicron VPI-5482作为突变体,鉴定了4种转座子突变体,约有3kb,通过对其它3株菌的该区域进行测序发现,BtCL15T12C11(BtCL15)与BoCL02具有100%的相似度,而其它两株相似度较低。插入基因的分析显示编码类似于具有 N-末端双甘氨酸肽酶的 ABC-样细菌素转运蛋白的蛋白质域。该家族的蛋白参与除去 IIa 类细菌素GG基序之后的前导肽及穿过革兰氏阳性细菌膜的分泌,编码具有类似于 IIa 类细菌素特征的小蛋白的基因也在该区域中。 为了确定分泌性毒素活性是否需要 TM 或硫醇氧化还原酶基因,在BtCL15菌株中分别构建这些基因的内部缺失突变体,这三个基因中任何一个的缺失导致减毒的毒素活性,当相应基因表达时,毒素活性恢复。通过联合对这四个基因的单独敲除与毒素分泌结果分析及构建大肠杆菌表达载体体系,从而确定了参与肽毒素分泌的四个基因区域。 3 两种肽毒素结构的分析 由图2中所示区域产生的两个肽毒素彼此相似67.2%, 两者都具有15个氨基酸的前导序列,预计在GG基序后被切割,产生42个氨基酸的成熟肽。每种肽具有四个半胱氨酸残基,其在IIa类细菌素中参与分子内二硫键。尽管具有与IIa类细菌素类似的一些性质,但肽缺乏IIa类细菌素中保守的YGNGVXC结构域,并且成熟肽与IIa类细菌素具有非常少的序列相似性。每个成熟的42个氨基酸具有12-13个疏水性氨基酸,并且两个成熟肽也具有一定的碱性,其中B. vulgatus肽具有+6的净电荷,并且Bo / Bt肽在pH 7下具有+ 2的净电荷。为了确定这些肽是否在GG基序上被切割并且它们是否可能形成二硫键,分析了在平板上生长的野生型BvCL01/BvCL14或BtCL15产生的肽,以获得比从培养的培养物中获得的更浓的毒素。结果表明,两种天然产生的肽在降低时迁移不同,与二硫键的存在一致。为了确定前导序列是否如所预测的那样在双甘氨酸基序上裂解,将如上所述制备的用于蛋白质印迹的样品浓缩,还原,烷基化,在聚丙烯酰胺凝胶上电泳并用考马斯染色。结果显示,切下蛋白质印迹指示的分子量范围内的蛋白质并进行LC-MS/ MS分析,分别鉴定了覆盖85.7%和81.0%成熟肽的片段。没有检测到对应于前导序列的任何部分的片段,而58和20个片段包括紧接在每个肽的GG位点之后的赖氨酸残基。 4 活性肽的生物合成与活性验证 为了确定这些肽是不是其抑制活性的主要影响因素,将合成的肽分子加以活性验证,结果显示,该肽对多种拟杆菌和拟杆菌属具有广谱抑制活性,但对其他不同门的肠道物种没有广谱抑制活性,还用合成的肽在肉汤培养中进行了生长曲线测定。该分子抑制覆盖试验中抑制的所有菌株的生长,但不抑制不同门的肠道菌株的生长,其最低抑菌浓度为31ng。 5 抑菌素A抑制不同生态系统的病原菌 利用在琼脂扩散试验和液体培养实验,进一步分析了合成的细菌素A对不同生态系统中的病原菌的攻击能力。这些菌株包括肠道菌、口腔炎和阴道的几种致病菌。结果除了两种(Prevotella nigrescens and P.gingivalis)其他均受抑制。 6 小鼠菌群移植水平的研究 7 人肠道宏基因组中肽毒素A和B普遍存在 8 由拟杆菌基因组编码的其它肽毒素 为了确定是否有其他拟杆菌基因组序列编码的肽类毒素,首先使用细菌霉素A和B的全长序列作为tblstn查询,以检测可能没有注释的小肽,这一分析揭示了三个新的肽,每一肽都有一个15-16氨基酸的先导序列,包括可能的gg切割位点,成熟肽在42-48氨基酸之间,且这些肽中的每一个都含有具有相似定位的四个半胱氨酸残基。将这些全长进一步做查询,共得19个肽,通过分析新推测的细菌肽周围的遗传区域,发现不仅含有一个推测的细菌霉素编码基因,而且还含有编码tm蛋白同源基因(ABC转运体/肽酶)的附加基因,以及大多数区域中的巯基氧化还原酶。这些区域编码的四个蛋白质的氨基酸水平相似性矩阵与其他每一个区域的相似蛋白质相比较。这些多肽与细菌毒素a和b的全长相似性有点弱;然而,它们都有15-16 氨基酸的类似先导序列和至少两个半胱氨酸残基,而且它们的预期辅助性基因非常接近。进一步的将与肽毒素A和B最接近的两个肽进行了抑菌活性检测,从而确定了结构不同的肽毒素C。 图7 结果 你可能还喜欢 这些或许也适合你哦👇 |
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