【福建农林大学】揭开铁观音“音韵”的神秘面纱

“铁观音”发源于福建省安溪县西坪镇，1985年被列为国家级良种。在铁观音的核心起源地，关于铁观音的起源，有尧阳村“皇帝赐名“的“王说”铁观音和松岩村“观音托梦”的“魏说”铁观音两种说法，“王说”铁观音和“魏说”铁观音的生理特性极为相似。此外安溪县的另外一类国家级良种“本山”，其香气、滋味等特征与“王说”、“魏说”的铁观音也很相似，但却唯独缺少了“铁观音”独有的“音韵”品质。时至今日，铁观音中“音韵”的形成机制尚未破解。因此，本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）结合转录组学技术，从分子生物学水平为大家破解铁观音风靡全球的“音韵”形成谜题。

作者于福建省安溪县西坪镇取茶树品种“王说”铁观音（TGY Wang）、“魏说”铁观音（TGY Wei）及本山（BS）母树的叶片为试验材料，采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）结合转录组学技术分析“王说”铁观音、“魏说”铁观音和本山中特征性次生代谢产物间的差异；运用转录组学技术揭示相关代谢的差异表达基因（DEGs），从而揭示铁观音中“音韵”形成的具体机制。

具体如下：

1、在形态特征方面~

“王说”铁观音和“魏说”铁观音均属于灌木型，中叶，晚芽种。“王说”铁观音和“魏说”铁观音的叶芽、第一叶及第二叶都是绿中带紫，但“魏说”铁观音的叶片比“王说”铁观音的更长更宽，而“王说”铁观音的百芽重却稍高于“魏说”铁观音。本山属于灌木型，中叶，中芽种，对比两种铁观音，本山有更早的发芽期和采摘期。此外本山的叶芽是浅绿色，第一叶和第二叶是浅绿带浅紫色的。本山的叶片比铁观音的短但却更宽，这与铁观音的长椭圆形状不同。

2、在叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量测定方面~

叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量的差异是构成“王说”铁观音、“魏说”铁观音及本山叶色差异的主要因素。研究发现“魏说”铁观音(2.53 mg/g)和“王说”铁观音(2.63 mg/g)的花青素含量差异不显著，但却明显高于本山(1.91 mg/g)。在类胡萝卜素含量测定的结果也是“王说”铁观音(0.47 mg/g)和“魏说”铁观音(0.46 mg/g)的花青素含量差异不显著，但却明显高于本山(0.30 mg/g)。此外在总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b的测定方面也发现，“王说”铁观音和“魏说”铁观音的含量均显著高于本山。

3、在总儿茶素、咖啡碱、茶氨酸和挥发物含量测定方面~

儿茶素、咖啡碱、茶氨酸在茶叶滋味形成方面占据了重要作用，挥发性香气物质的含量是决定茶叶香气和品质的重要因子。为探究“王说”铁观音、“魏说”铁观音及本山间内含物质的差异，作者运用HPLC分析三者间儿茶素、咖啡碱及茶氨酸的差异；同时利用GC-MS分析三者间挥发性香气物质的差异。其中中“王说”铁观音、“魏说”铁观音和本山的总儿茶素含量分别为118.35 mg/g、115.21 mg/g及87.12 mg/g，而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在“王说”铁观音(49.81 mg/g)及“魏说“铁观音(49.12 mg/g)中的含量均显著高于本山(40.19 mg/g)，对比没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)等的含量最高。总之，大多数类型的儿茶素在“王说“铁观音和“魏说“铁观音的含量高于本山。

“王说”铁观音(26.36 mg/g)、“魏说”铁观音(24.16 mg/g)的咖啡碱的含量显著高于本山(19.56 mg/g)，而对茶氨酸含量的分析中发现，“王说”铁观音(3.80 mg/g)、“魏说“铁观音(3.73 mg/g)及本山(3.59 mg/g)中的含量差异不显著。而铁观音和本山中挥发性香气物质含量排名前10分别为马鞭草烯酮(verbenone)、萜品油烯(terpinolene)、甲基环戊烯(methyl cyclopentene)、己酸己酯(hexyl hexanoate)、柠檬烯(limonene)、苯乙醛(benzene acetaldehyde)、α-法呢烯(alpha-farnesene)、罗勒烯(ocimene)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)和环己二烯(cyclohexadiene)，其中柠檬烯在“王说“铁观音(2.47%)、“魏说“铁观音(2.55%)显著高于本山(1.43%)，其余挥发性物质的含量在三者中差异不显著。因此推测高含量的儿茶素、咖啡碱和柠檬烯可能是影响铁观音“音韵”品质特征形成的重要因子。

4、在转录组数据方面~

通过转录组测序获得“王说”铁观音、“魏说”铁观音及本山三个文库，共15.03 Gb的原始数据，其中“王说”铁观音(21,533,093 clean reads)、“魏说”铁观音(26,931,717 clean reads)及本山( 26,690,143 clean reads)，Q30(测序正确率≥ 99.9%)、GC等数据。此外还将获得的转录组分别与两套茶树全基因组数据(C. sinensis var. Assamica & C. sinensis var.sinensis)比对，得到较高的匹配率，证明获得转录组数据可信。

5、转录因子富集分析~

转录因子富集发现，排名前5的转录因子家族(TF families)分别是bHLH转录因子(basic helix-loop-helix)、ERF转录因子(ethylene-responsive factor)、GRAS转录因、C2H2转录因子、和MYB-related TF families转录因子。

6、KEGG数据库分析“魏说”铁观音 vs.“王说”铁观音、“魏说”铁观音vs.本山、“王说”铁观音 vs. 本山的差异表达基因(DEGs)~

通过比对分析“王说”铁观音、“魏说”铁观音及本山的三组转录组数据，共获得12,420个DEGs。通过下图可以发现大多数DEGs在“王说”铁观音和“魏说”铁观音的转录水平相似，但与本山的差异较大。

KEGG注释后发现，其中多数富集途径隶属于代谢功能(metabolism)和生物合成(biosynthesis)，在这些富集途径中类黄酮生物合成途径(flavonoid biosynthesis pathway)；丙烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成途径(tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis pathway)；柠檬烯和蒎烯降解途径(limonene and pinene degradation pathway)的富集因子得分较高。鉴于类黄酮、咖啡碱和萜烯类化合物对茶叶风味和品质的影响，以及KEGG分析“魏说”铁观音vs“王说”铁观音的差异代谢通路的富集结果，重点选取了类黄酮、咖啡碱和柠檬烯的代谢途径，进行了更深入的研究。

在“魏说”铁观音 vs.本山、“王说”铁观音 vs本山中发现前10个富集途径中有6个是重复的，分别是：黄酮和黄酮醇的生物合成(flavone and flavonol biosynthesis)；硫胺素代谢(thiamine metabolism)；柠檬酸循环(TCA cycle)；丁酸代谢(butanoate metabolism)；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine, and isoleucine biosynthesis)；蛋白质输出(protein export)。基于铁观音与本山在叶色和感官品质上的差异，重点研究了与茶叶色素和品质相关的类黄酮代谢途径。

7、“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中类黄酮代谢途径相关DEGs~

为进一步分析“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中类黄酮代谢途径中DEGs的表达，共分析了30个注释这条代谢途径的DEGs。超过2个基因序列对应至PAL (编码苯丙氨酸解氨酶)，C4H (编码4-香豆酸辅酶A连接酶)，F3H (编码黄烷酮3-羟化酶)，FLS(编码黄酮醇合成酶)，DFR (编码二氢黄酮醇4-还原酶)和F3’H (编码类黄酮3′-羟化酶)；只有1个基因序列对应至CHS(编码查耳酮合成酶)，ANS (编码花青素合成酶)，ANR (编码花青素还原酶)，CCR (编码肉桂酰-CoA还原酶)。下图构建了拟黄酮代谢途径（A图）。根据FPKM值比较了

“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山上述基因的表达趋势，见B图，发现“魏说”铁观音和“王说”铁观音差别不显著，二者与本山差别较大；PAL、C4H、CHS、F3’H、F3H、DFR、ANS、ANR基因在“魏说”铁观音、“王说”铁观音中的转录水平均高于本山。与4CL、FLS和CCR相对应的7个基因序列在“魏说”铁观音、“王说”铁观音中的转录水平低于本山。这些结果表明类黄酮代谢在“魏说”铁观音、“王说”铁观音的代谢通量比在本山中的高；此外FLS的转录水平与黄酮醇生物合成呈正相关，而与花青素和儿茶素的积累呈负相关，因此本山中FLS的高转录水平可能影响黄烷醇、花青素和儿茶素的积累。

8、“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中咖啡碱代谢途径相关DEGs~

KEGG分析表明咖啡碱代谢途径是“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中具有代表性的代谢途径之一，共有31个DEGs与咖啡碱代谢途径有关。其中只有1个基因序列对应至AMPD(编码AMP脱氨酶)，超过2个基因序列对应至IMPDH (编码IMP脱氢酶)，SAMS (编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶)，5′-Nase (编码5′核苷酸酶)，XDH (编码黄嘌呤脱氢酶)。在此基础上，构建了拟咖啡碱代谢途径（A图）。同样根据FPKM值比较了“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山上述基因的表达趋势，见B图，在“魏说”铁观音、“王说”铁观音的咖啡碱代谢途径中中除了IMPDH 和SAMS，其余的关键基因没有显著差异。此外本山vs.“魏说”铁观音vs.“王说”铁观音，大多数参与咖啡碱代谢途径的基因在铁观音中的转录水平高于本山(AMPD、IMPDH、SAMS、5′-Nase)。此外还发现在本山中，XDH的上调会导致咖啡碱生物合成前体的竞争从而影响咖啡碱的积累。

9、“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中柠檬烯降解途径相关DEGs~

通过与KEGG通路的定位，鉴定了编码两种酶的基因序列。有1个基因序列对应于HIBADH(编码羟异丁酸脱氢酶)，还有超过2个的基因序列对应于ALDH(编码醛脱氢酶)。基于上述DEGs，构建了拟柠檬烯降解途径（A图）。根据FPKM值发现“魏说”铁观音和“王说”铁观音的ALDH和HIBADH基因的表达水平没有显著差异，但在本山中均显著上调。已知ALDH和HIBADH的表达水平与柠檬烯含量呈负相关，可见这两个基因的高转录水平导致了本山中柠檬烯的高分解。之前有研究表明，柠檬烯在茶叶风味形成中占据重要因子，可见柠檬烯可能是铁观音“音韵”形成的重要因子。

10、“魏说”铁观音、“王说”铁观音和本山中类黄酮和花青素合成过程中CsPAP 1 转录因子的分析~

在“魏说”铁观音vs.本山，“王说”铁观音vs.本山的转录组数据中发现PAP 1的FPKM值差异显著，共获得5条CsPAP 1 基因序列。基于此并选取其他物种PAP 1的序列，共同构建系统进化树，见下图。

同时对CsPAP 1 进行功能预测，表明其可能与EGL 3和bHLH共同促进苯基丙酸类类化合物(phenylpropanoid-derived compounds)的合成，如花青素和儿茶素等。PAP 1的表达可能与花青素和儿茶素的积累呈正相关，因此CsPAP 1转录水平的差异可能是铁观音和本山之间儿茶素和花青素含量差异的原因之一。

我们来划下重点~~以下内容~请看~~

利用高效液相色谱法和气相色谱—质谱法分析、转录组分析，表明“魏说”铁观音、“王说”铁观音属于姐妹系。类黄酮化合物（儿茶素）、咖啡碱和柠檬烯代谢产物大量积累；类黄酮代谢中PAL,C4H,CHS,F3’H,F3H,DFR,ANS，ANR等8个基因上调，FLS,CCR等2个基因下调；咖啡碱代谢中AMPD,IMPDH,SAMS，5′-Nase等4个基因上调，XDH 基因下调；柠檬烯代谢中ALDH ,HIBADH等2个基因下调；以及CsPAP1转录因子在铁观音中高表达水平成就了铁观音优良种性——“音韵”。

本课题研究团队（福建农林大学 园艺学院/园艺植物生物工程研究所 第一作者：郭玉琼；共同第一作者：朱晨；通讯作者：赖钟雄）