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编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 本研究从转录组和代谢组水平研究根限制（RR）对葡萄不同发育阶段主要酚类代谢产物及相关基因的表达水平。超高效液相色谱-高分辨质谱鉴定出7种酚酸类化合物，3种二苯乙烯类化合物，9种黄酮醇类化合物，10种花青素类化合物和24种原花青素类化合物。RR处理显著促进了酚酸、反式白藜芦醇、黄酮醇和花青素的生物合成，并影响了原花青素的含量，其含量在发育前期升高，后期降低。根据苯丙氨酸氨裂合酶，反肉桂酸4-单加氧酶，4-香豆酸酯-CoA连接酶，莽草酸O-羟基肉桂酰基转移酶，查尔酮合酶，查尔酮异构酶，二苯乙烯合酶，类黄酮3'，5'-羟化酶，花色素苷3的功能基因推断O-葡萄糖基转移酶以及转录因子MYBA1，MYBA2，MYBA3和MYBA22在RR处理调节的变化中起关键作用。 论文ID 原名：Transcriptomic Analysis of Root Restriction Effects on Phenolic Metabolites during Grape Berry Development and Ripening 译名：葡萄果实发育成熟过程中根系限制对酚类代谢产物影响的转录组分析 期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry IF：4.192 发表时间：2020年7月 通讯作者：孙崇德 通讯作者单位：浙江大学农业与生物技术学院 DOI号：10.1021/acs.jafc.0c02488 实验设计 结果 将测序数据与葡萄参考基因组比对后检测到29971个表达的基因。酚类化合物由苯丙氨酸通过类苯丙烷途径产生，是葡萄浆果中重要的次生代谢物。两组在生长过程中共有29个编码10种酶的基因显著差异表达。莽草酸O-羟基肉桂酰基转移酶基因在S1期上调，其他差异表达基因均在前期下调，后期上调。 2 苯丙烷途径中的化合物 表1葡萄浆果中酚类化合物检测的色谱和质谱参数 酚酸。酚酸是一类小分子化合物，可分为两大类：羟基肉桂酸(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、酒石酸香豆酯、酒石酸咖啡酯等)，羟基苯甲酸(对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、原儿茶酸、没食子酸等)。本研究在葡萄浆果中检测到七种酚酸类化合物及其衍生物（图1A）肉桂酸葡萄糖苷的含量在前三个时期呈下降趋势，然后逐渐升高，直至成熟。RR处理显著促进了肉桂酸葡萄糖苷的积累。在整个生长过程中，两组的其他酚酸均呈下降趋势。RR处理使阿魏酸、反式对铜绿酸和顺式对铜绿酸的含量在前期略有增加，但在后期略有下降。 二苯乙烯。二苯乙烯类化合物存在于葡萄浆果的果皮中，可被生物和非生物胁迫诱导。本研究中RR处理对葡萄浆果二苯乙烯含量的影响如图1B所示。吡啶类化合物是一种主要的二苯乙烯类化合物，苦皮苷浓度在S3期降至最低，然后缓慢上升至成熟期，并在S1期被RR处理降低。反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇则在发育后期积累。成熟时，RR处理的反式白藜芦醇含量(19μg/g干重)明显高于对照(8μg/g干重)。RR处理显著促进反式白藜芦醇的积累，但对顺式白藜芦醇含量影响不大。 黄酮醇。黄酮醇是一类黄酮类化合物，对葡萄浆果的口感、品质和营养起着至关重要的作用。本研究检测到9种黄酮醇化合物，分别是槲皮素、山奈酚、杨梅素及其衍生物（图1C）。RR处理显著降低了成熟期山奈酚的含量，但促进了不同发育阶段其他化合物的积累。在成熟期，RR处理对杨梅素-3-葡萄糖醛酸(18.1倍)、杨梅素(9.2倍)、山奈酚-3-葡萄糖苷(6.4倍)、杨梅素-3-葡萄糖苷(6.1倍)和槲皮素-3-葡萄糖苷(5.5倍)等物质的影响较大。 花青素。花青素是一种黄酮类化合物，在浆果皮中合成影响葡萄浆果的颜色。花青素的积累通常受环境因素如紫外线照射、温度和水分亏缺的调节。本研究共检测到10种花色苷，并根据花色苷的不同将其分为5类（图1D）。这些花色苷在对照样品中含量很低，而在RR处理样品中含量很高。 黃烷醇。黄烷醇是葡萄浆果中含量丰富的黄酮类化合物。黄烷醇从开花期到转色期合成，它主要影响食物和饮料的苦味、香气和涩味。葡萄中黄烷醇含量最高的是儿茶素，幼龄浆果中的黄烷醇含量超过10000μg/g干重，然后逐渐减少，直至成熟。RR处理不仅显著降低了各发育阶段的儿茶素和表儿茶素含量，而且促进了儿茶素和表儿茶素与没食子酸酯的聚合。另一方面，RR处理显著提高了幼浆期的总原花青素含量，降低了成熟期的总原花青素含量（图1E）。 原花青素。原花青素是一组由黄醇单元组成的聚合物，它通过类黄酮的生物合成途径合成并在成熟过程中减少。本研究从样品中鉴定出19种原花青素化合物，发现原花青素B1是葡萄浆果中含量最丰富的原花青素（图2）。 图1 RR处理对葡萄果实发育成熟过程中酚类物质含量的影响。A酚酸B二苯乙烯C黄酮醇D花青素E黄烷醇。 3 转录组和代谢组与苯丙烷路径的整合 本研究利用转录组和代谢组联合分析苯丙烷途径中在RR处理下的代谢变化（图3）。在许多水果的发育和成熟过程中，苯丙烷途径产生的酚类化合物在植物生长以及植物与环境胁迫的相互作用中起着关键作用，这些化合物具有从苯丙氨酸到香豆酰CoA的相同合成途径。葡萄浆果酚酸及其衍生物是由苯丙烷代谢的一个分支合成的。本研究发现，在S1期，阿魏酸和顺式柠檬酸含量的增加与HCT编码基因的表达上调相关性较高。说明HCT酶在胁迫下调节酚酸的生物合成起着关键作用。另一方面，PAL、CYP73A和4CL也调节酚酸的生物合成，而编码这些酶的基因表达与酚酸含量呈负相关。研究人员推测这些酶在酚酸的生物合成中起负调控作用，或者酚酸可能是挥发物和其他酚类代谢物生物合成的前体。 二苯乙烯类化合物通过苯丙烷途径分支出来的途径形成。该途径涉及四种酶：PAL、CYP73A、4CL和二苯乙烯合成酶（STS）。二苯乙烯家族包含几种通过修饰反式白藜芦醇合成的化合物。反式白藜芦醇通常在葡萄果实成熟期间积累，并可由生物和非生物胁迫诱导。葡萄的二苯乙烯含量与PAL、CYP73A、4CL和STS基因的表达高度相关。在本研究中，五个编码PAL的基因在RR处理下表达下调。编码STS的两个与苦皮苷生物合成的基因在浆果发育早期下调。在RR处理下，PAL编码基因的上调和4CL基因表达上调与反式白藜芦醇含量增加呈高度正相关。RR处理下，编码STS的基因都没有显著上调，但大多数STS编码基因的水平在转色后高于对照。研究人员推测编码STS的基因对反式白藜芦醇的积累具有联合调控作用。 葡萄浆果从开花到转色和成熟期间，通过类黄酮生物合成途径的一个分支合成黄酮醇，并在苯丙烷途径中与其他酚类化合物共享几个前期过程。研究发现1个CHI基因，1个E1.14.11.9基因，和4个CHS基因表达上调。在S3和S4期，10个CYP75A基因的表达与杨梅素、杨梅素-3-葡萄糖醛酸、杨梅素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷和山奈酚-3-葡萄糖苷含量的增加显著相关，这些结果进一步证实了黄酮醇在幼龄浆果中的合成，并在逆境下被诱导积累。由于山奈酚是其他黄酮醇的前体，所以在成熟时，RR处理组的山奈酚含量低于对照。槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖醛酸、杨梅素-3-葡萄糖醛酸、山奈酚-3-葡萄糖苷和山奈酚-3-葡萄糖醛酸在幼浆期合成，RR处理组含量高于对照。所以研究人员推测黄酮醇倾向于以葡萄糖醛酸形式存在于幼龄浆果中。 花青素是通过苯基丙醇途径合成的，在葡萄浆果的果皮中积累，在成熟的过程中，特别是在炎热的气候条件下，其含量会偶尔下降。BZ1基因是决定葡萄浆果花色苷最终含量和组成的关键因子。此外，类黄酮途径中的其他基因水平与花青素的含量和组成有很高的相关性。花色苷的含量和组成受环境因素的影响，如水分亏缺、温度、植物激素、紫外光照射、日照等。研究人员发现一个编码BZ1的基因在S3和S4阶段有显著的上调，这与花青素的增加是一致的。RR处理通过上调BZ1的表达，显著提高了花青素的含量。同时，花色苷含量与PAL、CYP73A、4CL、E1.14.11.9、CHS、CHI和CYP75A基因的表达水平有很好的相关性。RR处理显著诱导葡萄浆果花色苷的积累，进一步证实了BZ1在RR诱导的葡萄浆果花色苷积累中起重要作用。 黄醇单体是由中间体亮氨酸和亮氨酸在类黄酮途径中合成的。亮氨酸花青素还原酶(LAR)、花青素还原酶(ANR)和亮氨酸花青素双加氧酶(E1.14.11.19)参与了这一途径。原花青素是由黄醇单体的各种组合以齐聚物或聚合物的形式合成的，但原花青素的整个积累和聚合途径尚不清楚。黄醇与花青素具有相同的上游途径，黄醇与花青素的积累竞争所以浓度在成熟期逐渐降低。在整个生长过程中，LAR、ANR和E1.14.11.19基因的表达没有明显变化。RR处理早期，PAL，CHS和CYP75A编码基因的表达随儿茶素和表儿茶素的减少而下调。在花青素含量变化前，儿茶素和表儿茶素含量与原花青素含量呈负相关。变色期后，当更多的前体进入花青素生物合成分支途径时，RR处理葡萄浆果的总黄醇含量显著低于对照。 4 与次生代谢物积累相关的转录因子 与MYB蛋白一样，bHLH和WD40蛋白也是类黄酮生物合成途径中基因的主要转录因子。在葡萄浆果中，转录因子VvMYBA1和VvMYBA2调节一种负责花青素生物合成的酶BZ1基因的表达，同时也调节类黄酮途径中编码酶的基因表达，并导致花青素和原花青素的积累。VvMYBPA1和VvMYBPA2调控原花青素支路，VvMYBF1调控黄酮醇生物合成支路，这些转录因子的表达水平受环境胁迫的影响，与类黄酮途径中结构基因的mRNA水平相关。在本研究中发现了16个编码转录因子的基因可能参与了苯丙烷途径，这些基因在不同发育阶段经过RR处理后发生了明显的变化。VvMYBA3和VvMYBA22是VvMYBA1和VvMYBA2基因的同源物，可能在葡萄浆果花青素的生物合成调控中起关键作用。 5 qRT-PCR技术验证差异基因表达 为了验证转录组结果的准确性和重复性，随机选择5个与苯丙烷途径有关的基因进行qRT-PCR检测（图4）。线性回归分析显示总的相关系数为0.7639，表明定量的表达谱与RNA-seq值一致，表明转录组结果是可靠的。 图4 qRT-PCR验证葡萄浆果发育和成熟期间两个处理之间的差异基因表达。 结论 RR处理能改善葡萄果实品质，提高了果实的总糖和花色苷含量，丰富了花色苷组成。本研究首次研究RR处理对葡萄果实发育和成熟过程中其他酚类代谢产物变化的影响。本研究综合了转录组和酚类代谢产物，研究了田间条件下RR对葡萄浆果生长发育和代谢的影响，确定了RR处理在整个果实发育阶段所触发的代谢变化和分子途径，以揭示RR改变酚类代谢的机制。最后通过qRT-PCR对转录分析结果进行验证，填补RR处理对葡萄果实发育和成熟过程研究的空白。 更多推荐 1 高分综述 | Trends in Biotechnology: 单细胞分辨率下利用空间转录组揭示器官分子结构（国人佳作） |
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