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一氧化氮(NO)是一种重要的多功能生物分子，参与了多种生理和病理生理过程，包括血管调节、伤口愈合和神经元通讯；长期NO浓度升高与炎症性肠病、神经退行性疾病、癌症等疾病的发病机制有关。NO可以通过活性氮基团调节蛋白的翻译后修饰(包括亚硝化、硝化)，因此被认为是许多蛋白质的调节剂。目前已知的检测内源性NO在生命体中功能的方法有很多，但没有用来分析处于NO环境中的蛋白质的方法。 本文作者基于N-酰基邻苯二胺衍生物的结构，开发了一种能在高浓度NO和有氧条件下被激活的试剂，可以响应内源外源的NO并用荧光基团标记响应NO的蛋白质，同时能够与LC-MS/MS及荧光成像技术结合应用。 首先，作者准备使用N-酰基邻苯二胺的结构，通过Linker链接香豆素基团以组成标记试剂。测试了不同的Linker和N-酰基邻苯二胺苯环上的取代基团组成的试剂，在NOC-7试剂提供的NO环境下对单蛋白BSA进行标记，最终选择了对NO有较强特异性响应的NOAR-1作为标记试剂骨架。 接着，他们研究了NOAR1在高浓度NO和有氧环境下对蛋白的标记反应机理和标记动力学。在这里，他们对NOC-7和NOAR-1处理后的Hela细胞裂解物进行LC-MS/MS测试，发现亲核氨基酸残基能够被大量酰化标记，大部分是Lys、Ser、Thr。 之后，他们将带有荧光基团的NOAR-2用在含有NO合成酶（iNOS）的小鼠巨噬细胞RAW264.7中。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）发现，在NOC-7提供外源NO、脂多糖/炎症因子（LPS/IFN）诱导产生NO和诱导iNOS表达产生内源NO的情况下，NOAR-2都可以标记蛋白显示荧光信号。在RAW264.7与Hela的混合培养细胞时，只有RAW264.7在LPS诱导下产生荧光，证明应用NOAR-2可以在空间分辨率的单细胞水平上标记NO相关的细胞。 此外，利用质量指纹技术表征受NO刺激的RAW264.7细胞蛋白质组。使用抗体通过免疫沉淀富集被荧光标记的蛋白，凝胶消化后用LC-MS/MS测定；将受LPS刺激的重标样品与未受刺激的轻标样品以1:1的比例混合，进行标记蛋白变化情况的测试。检测结果表明内源NO的产生导致蛋白质被标记。将有显著变化的蛋白进行基因本体分析及荧光成像分析，发现大多数蛋白位于内质网；与氧化还原稳态和蛋白质折叠相关的蛋白也被富集到。 更进一步对这些蛋白进行western blotting分析，发现蛋白标记信号的变化并不完全与表达水平的变化同步。通过DNA微阵列分析刺激后mRNA表达的全基因组变化，发现了4个应用NOAR-2被富集的蛋白与mRNA水平增加呈正相关。这些表明结合NOAR-2和蛋白质组学技术可以反映NO诱导下内质网应激调节的蛋白质表达水平变化，同时也可反映NO周围环境。 总之，作者成功开发了一种针对NO响应蛋白的标记试剂，可以很好结合荧光成像和蛋白质组学技术进行研究及分析，有望应用于选择性成像和分析更复杂系统（如组织）中富NO环境的研究中。 作者：MYZ |
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