啥是荧光定量PCR
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啥是荧光定量PCR  实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR），简称Q-PCR，是一种在扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定基因序列进行定量分析的方法。 Q-PCR有三个特别重要的指标  扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映Q-PCR的动态进程。 溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。 荧光阈值 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期（分为基线期、指数期以及平台期）。 Ct值 PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。  Q-PCR数据分析·2-ΔΔCt法  1.内参基因Ct值归一目标基因Ct值： ΔCt(test)=Ct(target, test)-Ct(ref, test) 2.对照样品ΔCt值归一实验样品ΔCt值： ΔΔCt=ΔCt(test)-ΔCt(control) 3.计算相对表达量： 相对表达量=2-ΔΔCt 常见问题解答 一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是绝对的，需要辅以溶解曲线或电泳结果加以解释 一般是由于模板不足或降解，亦或是引物降解 模板的起始浓度过高，可以降低模板浓度 扩增产物过大或模板降解，亦或是PCR反应条件不够优化 这样一般都是由于有DNA的污染。 这里奉上经过大量实验总结的小窍门
模板制作,小便宜别去占 所谓的目标模板也就是我们常说的阳性对照，你可去购买现成的，当然实验经费不充足一般都要我们自己制备。在这里提醒广大宝宝们不要为了省那点钱而去买便宜的载体，最好购买师兄师姐或者有类似经验的人推荐的载体。 测定模板浓度时最好选用微量核酸测定仪，每次仅需要1-2ul的样品，既不会污染你的样品也不用像紫外分光光度计那样需要稀释，简单、精确、灵敏。实验中对模板进行稀释时，尽管每次使用的量很少，推荐一次性吸取10 ul倍比稀释，因为量越多误差也就越小。 引物印证这一步，别小觑 当拿到公司合成好的引物时，先通过普通的PCR来初步印证一下，扩增条带是否单一，条带大小是否的在预计的范围。若不符合这些，直接不用进行荧光定量PCR，重新设计引物。若符合条件，接下来就进行荧光定量PCR实验，观察扩增取曲线，以及熔解曲线是否单一。满足条件后可开始正式的荧光定量PCR实验，一般每稀释一个梯度，CT值差3左右。 程序设置，听说明书，还是机器设定？ 实验开始前，我也看了很多文献啊各种机器的介绍啊，大部分是要求按照机器自带的程序或已经设定好的程序进行就可以了。但我比较了我的荧光染料说明书的要求的程序与机器设定好的程序，相差太大。说明书中说预变性温度不要超过30s，会影响染料的活性，可是机器设定的是预变性5min，这个时候你一定要按照说明书的来哦。
捷瑞家可以提供的 根据您要检测的物种/基因，专业实验团队为您量身定制引物和探针，并进行优化调试 在您开始实验之前，本公司将为竭诚您提供最有效的荧光定量PCR技术服务方案 接受采用荧光定量PCR的检测方法针对各种检测目标的合作研发和委托研发 mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA表达检测 基因拷贝数检测（土壤中细菌、真菌、固氮菌等含量的检测和功能基因检测） 服务流程 样品核酸提取 PCR引物设计与合成 ↓ 引物调试（预实验） ↓ PCR扩增检测 ↓ 数据汇总初步分析 标准品合成及标准曲线构建（绝对定量） 我们的检测方法 SYBR GREEN I法 Taqman探针法
1、严谨的实验设计，每个样品提供三复孔重复数据，保证实验结果的准确性。 需要您提供的 基因名称（提供Genbank登录号），待测样本（清晰样品编号），以及详细的实验要求和数据分析要求。 样本寄送 1、可检测样本：组织、细胞、cDNA，RNA样品等 2、捷瑞生物可免费提供RNA保存液 3、样品收到后会进行样品评估，评估结果会及时反馈给客户确认 4、关于取样送样有任何疑问，可详询support@generay.com.cn或021-67840418并索要《捷瑞生物荧光定量PCR送样指导书》
检测周期 常规检测任务最快一周即可完成，样品数较多或检测条件需要反复优化的情况下，时间适当加长 报告内容 1、 样品评估结果（RNA或DNA浓度、电泳图片等） 2、 引物调试与样本扩增结果（扩增曲线/溶解曲线/标准曲线） 3、 定量PCR原始数据结果 4、 Ct值和RQ值 5、 数据统计分析（可选） 6、 实验报告使用说明 床前明月光 年后你别慌 实验你找我 电话在下方 |
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