一、历史
1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。当时他使用了B（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值，利用了PCR反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快的到大家的接受，并广为应用。现在的定量PCR 仪有 ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM® StepOne TM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5®、MyiQ®、MJ Research Chromo4 TM Opticon 系列；Stratagene Mx TM 系列；Roche LightCycler®系列； Eppendorf Masercycler®；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler® 和 BIOER 的 LineGene 系列。
二、基础知识
所谓定量 PCR 技术（real-time PCR），是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
与常规PCR的区别
常规 PCR 中， PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规 PCR 只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析；荧光定量 PCR 中， PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使 PCR 产物的实时检测成为可能。相对常规 PCR 而言，荧光定量 PCR 的主要优点是准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量 PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；
常规PCR 的定量方法，测定的都是 PCR 的终产物，而不是起始DNA 拷贝数。而从图中可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行 96 次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR 中 Ct 值的重现性，恒定的Ct 值为荧光定量 PCR 的分析提供了理论依据。
三、QPCR检测方法
Real Time PCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光检出方法可分为荧光嵌合法和荧光探针法两大种类。
荧光嵌合法(SYBR Green I)的原理
荧光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合,在激发光照射下产生荧光,通过荧光强度的检测,可以实时监测PCR扩增的产物量。
荧光探针法的原理
荧光探针有很多种类,这里介绍两种荧光探针检测方法,即 Taqman Probe法和 Cycling Probe法，主要介绍Taqman Probe法
Taqman Probe法
Taqman Probe法是使用5’端带有荧光物质(如:FAM等),3’端带有淬灭物质(如: TAMRA、 Eclipse、BH1Q等)的 Taqman探针进行荧光检测的方法。当探针完整时,5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约,不能检出荧光。当 Taq Man探针被分解后,5’端的荧光物质便会游离出来,发出荧光。当PCR反应液中加入荧光探针后,在PCR反应的退火过程中,荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中,DNA聚合酶的5’→3’ Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针,游离荧光物质发出荧光,通过榜测反应体系中的荧光强度,可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
如何选择QPCR检测方法
四、QPCR 几个基本概念
扩增曲线
为了更好的理解荧光定量 PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。 描述 PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。 PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈 S 型曲线。图中， X－轴表示 PCR 循环数， Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
从图可以很直观的看出，荧光定量 PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
荧光阈值
在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号，我们一般把荧光PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是 3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍（仪器自动设置）。我们在做荧光定量 PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。
Ct 值
了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C 代表 Cycle，t 代表 threshold，所谓 Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如上文中图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为 Ct 值。从这也可以了解到 Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量 PCR 后面的数据处理要用到 Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光 PCR仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为 Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少， Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT值范围在 18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过 96 次 PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的。Ct 值做出标准曲线，只要在同一次 PCR 实验中得到未知样品的 Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。
标准曲线
在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct 值推算出。在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释（5－6个稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR 实验中进行反应，将稀释标准品得到的 Ct 值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量。标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果PCR反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式“2n＝稀释倍数”，n为 2 样本间Ct值差。例如：10 倍稀释的样本， 2n＝10，可得n3.32，Ct值差3.32。
扩增效率
在绝对定量中，我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光 PCR 实验，利用拷贝数和 Ct 值做成标准曲线，利用递减的直线关系等式和相关系数（r）或
可信度来计算扩增效率。扩增效率与标准曲线的斜率相关， 计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中， PCR产物的量加倍，即PCR产物 2 倍增加，反应效率为 2，扩增效率就为 2，就可得 2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率的绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的 PCR反应，E=2，即：扩增效率 E%=(2-1)×100%=100%如果 E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92 倍，或每次循环有 92％的模板被扩增。一般说来，扩增效率接近 100％是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在 90％－105％之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于 100％时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低，导致反应的 Ct 值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的 Ct 值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于 90％或大于 105％，建议重新设计引物或探针。
五、QPCR实验方法
逆转录反应
Two Step rt-pcr和 One Step rt-pcr的选择
Real Time RT-PCR反应可选择 Two Step rt-pcr反应或 One Step RT-PCR反应, Two Step RT-PCR反应是将反转录反应和 Real Time PCR反应分两步进行。进行 Two Step RT-PCR反应时,可选择 Random Primer 、Oligo dtPrimer或基因的特异性引物进行反转录反应,然后再将一部分反转录反应液(cDNA)作为模板添加到 Real TimePCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择最合适的反转录引物,如果选择 Random Primer或 Oligo dtPrimer,合成的cDNA可用于复数种类基因的检测,cDNA溶液可以稳定地长期保存,供以后解析使用。
One Step rt-pcr的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行,操作简单,污染几率低。但此时的反转录反应和PCR反应都并非为各自的最适条件,所以 One Step rt-pcr通常比 Two Step RT-PCR反应效率低。此外,与 Two StepPCR反应相比,反转录酶等的使用量多,每个反应的成本相对较高。 One Step rt-pcr反应的反转录反应引物只能使基因的特异性PCR下游引|物,而不能使用 Random primer或 Oligo dt Primer共用引物。基因表达解析等绝大部分RT-PCR,最适合选择 Two Step rt-pcr反应,而RNA病毒检测等以基因检测为目的RT-CR反应,应优先考虑防止污染,所以最好选择 One Step rt-pcr反应。
逆转录中几种不同引物的选择
三种引物与RNA模板的相对位置
RandomPrimer
通常基因表达解析,Random Primer最适合。Random Primer能够高效率反转录全长mRNA,所以不管目的片段在mRNA的任何位置都能很好地进行表达解析。Oligodt Primer:
想从Poly(A)尾开始反转录反应时,使用Oligo dt Primer.。但是如果目的片段距离Poly(A)尾过远,反转录效率将会降低。所以,Oligo dt Primer最好与在距离Poly(A)尾1.5kb以内的PcR引物组合使用。
GeneSpecific Primer:
进行 One Step rt-pcr反应时的反转录引物只能使用基因特异性下游引物,而不能使用Random Primer和 Oligo dt Primer。对于基因表达解析这样的复数基因检测,不适合使用Gene Specific Primer
QPCR反应
引物和探针设计原则
引物设计原则
探针设计原则
PCR条件优化顺序
QPCR结果与数据分析
熔解曲线分析
采用 SYBR Green I荧光嵌合法检测时,可以通过溶解曲线分析,确认PCR反应的特异性,如下图所示,融解曲线分析是在PCR反应结束后,将PCR反应液的温度渐渐升高,实时监测 SYBR Green I的荧光信号强度变化进行的。起初由于PCR扩增产物呈双链,具有较高的荧光信号强度,随着温度的渐渐升高,DNA双链渐渐打开,嵌入DNA双链中的 SYBR Green I数量减少,荧光信号强度就渐渐降低,当双链DNA解链一半时,荧光信昼强度急剧下降,此时的温度即融解温度（Tm值）,Tm值与PCR扩增产物的序列有关,对于某一PCR扩增产物,其值是固定的。左图为融解曲线的一次曲线,右图为融解曲线的负一次微分曲线,通常使用融解曲线的负一次微分曲线进行融解曲线分析的较多。
不同溶解曲线
相对定量的数据处理方法
对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双标准曲线法、△Ct、2-△△Ct、用参照基因的△Ct法和Pfaffi
法，应用每种方法都有适应条件。
根据实验要求可选用相应方法
而目前相对定量普遍采用操作简便的 2-△△Ct分析方法。
六、常见问题
1、无 Ct 值（信号）出现
（1）反应循环数不够：一般都要在35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45 个循环会增加过多的背景信号；
（2）检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；
（3）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
（4）探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；
（5）模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；
（6）模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生
2、值出现过晚
（1反应条件不佳：未最佳反应条件， 可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；
（2）CR各种反应成分的降解或加样量不够；
（3）增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
3、阴性对照也出现明显的扩增
（1）光 PCR mix 或水被污染；
（2）引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；
4、溶解曲线不止一个主峰
（1）引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；
（2）引物浓度不佳：适当调整引
（3）退火温度低：提高退火温度；
（4）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度
（5）模板中有基因组的污染：RNA提物设计避免非特异扩增。
5、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲
（1）基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；
（2）模板量过多：当扩增曲线在 10 个循环内起峰时，应将模板稀释 10
倍后使用。
6、重复性不好
（1）加样不准确；
（2）仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；
（3）模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
7、荧光定量 PCR CT 值一般在多少后认为模板没扩增
当进入对数期的循环数大于 35 时，RealTime RT-PCR 检测无效，基因没有
表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
