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作者首先对单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 数据进行分析，发现肠道干细胞可进一步分成3个亚类：相对静息状态的 ISC-I 和高增殖的 ISC-II、ISC-III。分析提示 ISC-I 更倾向干性状态而 ISC-II、ISC-III 则偏向于分化状态，而且 ISC-I 和 ISC-III 高表达 MHCII 抗原呈递分子。作者使用 RNAscope® 多重荧光检测技术与免疫荧光技术在对上述结果进行了验证。 Fig1. Validation of ISC subsets and their cell cycle status. RNAscope smFISH detection of pan stem cell marker Lgr5, ISC-I marker Cyp2e1 and ISC-III marker Psrc1 all in red and Mki67 in white. Cell borders were assessed with IF for E-cadherin in green. ISCs 表达的 MHCII 是否有意义呢？作者在体外共培养实验中，发现这些 ISC 可与 CD4+ 辅助性T细胞 (Th) 互作，并递呈抗原。通过使用肠道类器官，作者发现 Th1、Th2 和 Th17 及其细胞因子 IFNγ、IL13、IL17 等促炎信号可促进 Lgr5+ ISC 的分化，而调节性T细胞 (Treg) 及其细胞因子 IL-10 则促进 ISC 的自我更新； 接下来作者在体内研究了 MHCII 对于 ISCs 的自我更新和分化的影响。作者通过对 MHCII 条件性基因敲除小鼠 MHCII△Gut 小鼠和对照小鼠的肠上皮细胞进行 scRNA，发现敲除鼠的 ISCs 的比例增加，其中 ISC-II 的比例相对更高一些。同时还发现敲除鼠的隐窝固有层中 Th 细胞减少。在另一种 MHCII 条件性基因敲除小鼠 MHCII△ISC 小鼠中也发现了 LGR5+ ISCs 的增多。这些结果表明，MHCII 对 ISCs 的自我更新和分化有明显的作用。 接下来作者使用沙门氏菌 (Salmonella enterica) 和多形螺旋线虫 (Heligmosomoides polygyrus) 两种经典模型，分别模拟小肠细胞对病原菌和寄生虫的反应，并利用 MHCII 条件性基因敲除小鼠 (MHCII△Gut 小鼠和 MHCII△ISC 小鼠)，研究不同感染时肠上皮细胞分化和重塑以及 MHCII 在其中发挥的作用。发现野生小鼠感染模型中，干性基因表达降低，而 MHCII 表达增加，而且 ISC 亚型发生转变，ISC-I 降低、ISC-II 和I SC-III 增加。沙门氏菌会诱导 Th1 反应，增加 Paneth 细胞数量；而多形螺旋线虫则会引起 Tuft 细胞的扩增。 在 MHCII 条件性基因敲除小鼠 (MHCII△Gut 小鼠和 MHCII△ISC小鼠) 感染后，发现多形螺旋线虫感染的基因敲除小鼠中 Tuft 细胞几乎不扩增，而且 LGR5+ ISCs 数量也增加。这些结果说明 MHCII 对于病原菌和寄生虫感染状态下的 ISCs 的维持有重要作用。而在对敲除小鼠的免疫细胞进行 scRNA 分析后，作者还发现表达在肠上皮细胞上的 MHCII 分子对于肠道的免疫系统包括固有免疫和获得性免疫反应都有重要的影响，敲除上皮细胞的 MHCII 会扰乱粘膜免疫反应。 最后作者在体内利用 Foxp3-DTR 小鼠研究了 Treg 细胞对于 LGR5+ ISCs 的影响。发现 Treg 缺失会引起成熟肠上皮细胞减少、LGR5+ ISCs 减少、ISC-II 和 ISC-III 的比例增加。 作者根据以上结果总结了 ISCs 与 Th 细胞的相互作用。Treg 和其分泌的细胞因子 IL-10 能促进干细胞的自我更新；Th17 和其分泌的 IL-17a 则抑制干细胞的自我更新、促进其分化。Th1 和 Th2 以及其各自分泌的细胞因子也会抑制干细胞的自我更新，促进干细胞分别向 Paneth 细胞和 Tuft 细胞分化。 在本研究中，研究人员联合使用了单细胞RNA测序 (scRNA-seq)、RNAscope® 多重荧光检测技术、类器官培养、细菌感染模型、寄生虫感染模型和其他技术，揭示了 ISCs 与 Th 细胞的相互作用以及对于肠上皮细胞维持的影响。发现了一类表达 MHCII 的 ISCs 具有向辅助性T细胞呈递抗原的能力。不同类型的 T 细胞及其细胞因子则对 ISC 的分化和自我更新起不同作用，从而影响小鼠对肠道感染的抵抗力。 本文是该课题组继2017年在《Nature》发表题为“A single-cell survey of the small intestinal epithelium”[2] 的文章后又一重要成果。这些发现为干细胞与免疫细胞间的互作提供了新机制。 RNAscope® ISH 技术是由 Bio-techne旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研发的 RNA 原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的 RNA 原位杂交相比， RNAscope® ISH 技术属于新一代 RNA 原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链 RNA 探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标 RNA。 该技术优势如下： 应用广泛: 使用RNAscope® ISH 技术，靶点 RNA 为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而 RNAscope 技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。 特异性：RNAscope 独特的双Z (ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要 2~4 周时间即可完成。 灵敏度：RNAscope® ISH 技术检测每个 RNA 分子时，只需三对双Z (ZZ) 探针即可完成杂交和信号可视化。 单分子可视化和单细胞定量: 使用 RNAscope® ISH 技术杂交上三对及以上双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。 兼容降解的RNA: 由于仅利用三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。 检测结果稳定一致性：由于工业化合成 RNAscope® ISH 技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型 (冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等) 已经有成熟的实验操作流程，故使得 RNAscope® ISH 技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在 Leica 以及罗氏 Ventana 自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。 多通道多靶点同时检测：由于 RNAscope® ISH 技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。 Reference: 1. Biton, M.H., Adam L.; Rogel, Noga; Burgin, Grace; Beyaz, Semir; Schnell, Alexandra; Ashenberg, Orr; Su, Chien-Wen; Smillie, Christopher; Shekhar, Karthik; Chen, Zuojia; Wu, Chuan; Ordovas-Montanes, Jose; Alvarez, David; Herbst, Rebecca H.; Zhang, Mei; Tirosh, Itay; Dionne, Danielle; Nguyen, Lan T.; Xifaras, Michael E.; Shalek, Alex K.; von Andrian, Ulrich H.; Graham, Daniel B.; Rozenblatt-Rosen, Orit; Shi, Hai Ning; Kuchroo, Vijay; Yilmaz, Omer H.; Regev, Aviv; Xavier, Ramnik J., T Helper Cell Cytokines Modulate Intestinal Stem Cell Renewal and Differentiation. Cell, 2018. 2. Haber, A.L.B., M.; Rogel, N.; Herbst, R. H.; Shekhar, K.; Smillie, C.; Burgin, G.; Delorey, T. M.; Howitt, M. R.; Katz, Y.; Tirosh, I.; Beyaz, S.; Dionne, D.; Zhang, M.; Raychowdhury, R.; Garrett, W. S.; Rozenblatt-Rosen, O.; Shi, H. N.; Yilmaz, O.; Xavier, R. J.; Regev, A., A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature, 2017. 551(7680): p. 333-339. |
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