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来源：血液病整合诊断 小编在征得卢兴国老师的同意，转载他的文章以及发于他的微信平台：血液病整合诊断 的文章，血液专业的指南！值得我们认真学习收藏！感谢原作者的辛苦付出！ 附2017年出版的修订第四版WHO有关MDS标准与2016年不同的最新解读 叶向军 卢兴国 紧贴临床、形态为本、整合诊断、满意临床和学术提升是我们实验室诊断的宗旨和理念（20字理念，详见本公众号“感想谈11——血液病整合诊断学”）。我们认为，以形态学诊断为本（基础），整合当前新的诊断技术也是血液病整合诊断甚至所有病理诊断的主流方向。在接下来的几篇公众号号上，我们陆续介绍一些分子诊断技术的长处与不足，以及这些技术在血液病，尤其是血液肿瘤方面应用的意义。 同时，我们从这期起，陆续介绍2017年出版的修订第四版WHO分类与2016年在“Blood”杂志上发表的不同内容（标准）进行解读，作为我们在2016年本微信公众号感想谈4——WHO造血和淋巴组织肿瘤分类及其诊断11篇解读文章的补充。2016年5月份Blood 杂志刊登了由Daniel A. Arber等撰写的介绍2016修订第四版WHO分类的髓系肿瘤和急性白血病更新要点。我们曾在第一时间作了翻译和解读，得到国内较多同行的关注。但真正的修订第四版WHO分类专著却不是Daniel A. Arber等在Blood文章所说的将在2016年出版，而是直到2017年9月底才出版，有些内容也与Blood 杂志刊登的不完全相同。本文介绍2017年出版修订第四版中MDS诊断与2016年若干变化的最新解读。 在检测特定分子异常（易位、缺失、倒位或点突变）时，通常需要在标本采集和提取核酸之后进行特定DNA片段的扩增。聚合酶链反应（PCR）技术是在20世纪80年代，穆利斯与其同事开发的根据生物细胞内DNA半保留复制原理设计的一种体外核酸扩增技术。这一技术大大提高了分子生物学检测的敏感度，并能对少量的组织以及归档的石蜡包埋材料进行分子诊断分析，促进了分子检测的发展。而定量PCR等技术的出现进一步提高了PCR技术的性能和应用范围，在各级临床实验室得到迅速推广。在造血和淋巴组织疾病中，PCR也已被纳入诊断程序而成为领先的辅助诊断技术，可用来证明细胞克隆性和系列、确定特定的基因重排、识别各种突变和检测微小残留病（MRD）。 一、标准PCR 在PCR技术中，DNA和由RNA逆转录形成的cDNA作为模板，正向和反向DNA引物结合到目标DNA的特异性区域，Taq聚合酶同时延伸DNA双链。在模板DNA、引物、四种dNTP、DNA聚合酶和反应缓冲液等存在下，经多次扩增合成大量新DNA链。因为它采用与DNA链特定区域互补的正反两个小分子量引物进行DNA聚合，所以该技术具有内在特异性。 标准PCR的特征和一般原则主要有以下几个方面： 1．模板DNA 模板DNA可从新鲜、冷冻、福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）等标本中分离出来，也可以是从RNA逆转录获得的cDNA。目标通常是长度为200～2000个碱基对的短片段。FFPE标本通常有DNA的断裂并产生较小的DNA长度。 2．制备针对目标区域的引物 引物设计是PCR敏感性和特异性最重要的因素。提供反应的特异性。应针对独特序列。与相反链互补（互为正向和反向）。设计成产生的扩增子包括相反引物的结合位点。不得有内部同源性，或者会发生部分双链（二级）结构。不得含有与其他引物互补的区域，否则引物发生杂交（引物二聚体）。引物长度影响特异性、反应温度和反应效率。通常长度为17-30个核苷酸。GC含量应为45～55％。通常3'末端为G或C以提高特异性。退火温度应较熔解温度低5°C。许多网上工具可用于底物设计。 3．热稳定DNA聚合酶 最常用的是水生嗜热菌源生的聚合酶（Taq）。有5'至3'聚合酶活性。有5'至3'外切核酸酶活性。每个碱基对的错误率：1x 10-4到2×10-6。用其他聚合酶可有较低的错误率和3'到5'外切核酸酶活性。改进的Taq聚合酶经过修改可防止低温活性及引导错误并提高特异性。 4．合成DNA所需的dNTP 过多dNTP导致特异性下降。 5．反应缓冲液控制pH和离子浓度以获得最佳性能 最适pH通常在8到10之间。聚合酶的性能需要镁离子（Mg2+）。较低的Mg2+增加引物-模板结合的特异性。较高的Mg2+降低反应特异性并抑制变性。Mg2+和pH必须针对特定的引物和期望的结果进行优化。可包括添加剂，如牛血清白蛋白（BSA）和二甲基亚砜（DMSO）。 6．反应取决于温度循环 热循环器可以调整每个步骤的温度以改变反应的灵敏度和特异性。样本被加热到熔点，DNA变成单链（变性阶段）。通常在92～94℃左右，约1分钟。冷却样本使引物和模板结合（退火阶段）。退火阶段的温度取决于具体引物长度和序列。可以调节温度以改变结合的特异性。 二、PCR方法改良与发展 PCR可以说是分子诊断中最重要的技术，经扩增后使得特定DNA或RNA序列可以检测到经典遗传学分辨率以下的微小改变，可以识别血液肿瘤和其他血液病相关的特异性分子学改变。很多经过改变的PCR方法还适合各种不同的核酸异常，在血液病分子诊断中发挥独特作用。常见的有以下几种。 1．实时定量PCR技术 实时定量PCR（RQ-PCR），即为荧光定量PCR，是在PCR过程中加入荧光基团，用于实时监测PCR进程，根据每个反应管内荧光信号到达设定阈值所经循环数，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，是目前用于定量DNA或RNA最准确的方法，并可以获得分子学反应、MRD检测等疾病治疗中有用的信息。 目前在血液病分子诊断中，RQ-PCR用于治疗后MRD的监测，特别是对于ALL、AML和CML。微小残留病的数量可用于临床评估治疗效果，以确定进一步的治疗类型和时机，以及用于预后信息评判。RQ-PCR也被用于骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F等位基因的负荷检测。 2．逆转录PCR技术 逆转录PCR（RT-PCR）技术是一种利用RNA依赖性DNA聚合酶——逆转录酶，使用RNA作为模板的DNA聚合反应。当扩增模板为RNA（如融合转录本）时, 需先通过逆转录酶将其逆转录为cDNA才能进行扩增，且所得cDNA链比目标RNA稳定得多，还可用作后续PCR的模板。 血液病中RT-PCR检测的应用包括各种融合转录本的测定。跨越染色体易位的基因组DNA长度通常不能通过PCR来检测。目前，采用RT-PCR检测的融合基因包括CML、ALL和AML中的BCR-ABL，ALL中的ETV6-RUNX1和E2A-PBX1，AML中的PML-RARA、CBFB-MYH11、RUNX1-RUNX1T1和DEK-NUP214，间变性大细胞淋巴瘤中的NPM-ALK，以及滤泡淋巴瘤中的BCL2-IGH。通过RT-PCR检测这些染色体易位对于诊断时风险分层和治疗决策，以及治疗后监测MRD的存在都有很大意义。 3．巢式PCR技术 巢式PCR（NEST-PCR）技术为先用一对靶序列的外引物扩增提高模板量, 然后再用一对内引物扩增得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一对外引物和一个内引物则称之为半巢式PCR。还有一种减少操作步骤、降低了交叉污染的中途进退式PCR(drop-in, drop-out PCR)。这三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增检测。 4．等位基因特异性PCR技术 扩增阻碍突变系统（ARMS）或等位基因特异性PCR（ASPCR）是根据引物3'端碱基必须与待扩增的等位基因互补的原理。在该系统中，设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个平行PCR，唯有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3'端则导致PCR不能延伸。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物，可用于检测基因点突变和单核苷酸多态性。 5．单链构型多态性PCR技术 单链构型多态性PCR(SSCP-PCR)技术是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。 6．复合PCR技术 复合PCR（multiplex PCR）技术是在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。这一技术主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的血液分子病的诊断。 三、检测技术 可用许多不同方法对PCR扩增产物进行分析。传统上，最直接的方法是用凝胶电泳分离DNA片段，并在染色后呈现。最常使用的是用溴乙锭染料嵌入DNA标记DNA片段并进行检测。现在，凝胶技术已在很大程度上被其他形式的片段分析法取代，其中最常见的是毛细管电泳。 1．毛细管电泳 毛细管电泳技术（CE）泛指在高散热效率的20～100μm毛细管内,在筛分机制（有或者无凝胶）和高强度电场的双重作用下, DNA片段因分子表面积和外形不同导致的迁移率差异而分离DNA的技术。CE可用于DNA序列分析和DNA片断长度分析外，作为一种高通量的手段在单核苷酸多态性（SNP）和突变筛查方面得到广泛应用。在扩增后，常通过CE检测扩增片段的长度，来检测有无Ig或者TCR基因克隆性重排，以确定淋巴细胞是否为克隆性（图1）。
上方和中间框内显示单克隆峰，代表基因克隆性重排；下方框内显示多克隆模式 2．质谱法 质谱法常用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物SIAB共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火、延伸反应、突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰。将碱基进行一定的修饰, 可进一步提高敏感性。 3．单链构象多态性分析 单链构象多态性分析（SSCP）是双链DNA的PCR扩增子，通过热变性产生单链片段，然后通过聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。在电泳过程中，单链DNA根据序列的不同折叠成不同的三维构象，可用于点突变的筛查。 4．限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性（RFLP）分析仍是PCR产物的常用检测方法。限制性核酸内切酶是一种能识别并作用特定核苷酸序列的双链DNA内切酶，通常活性的目标为4～6个bp（碱基对）长度的核苷酸序列。经限制性内切酶消化后，用凝胶电泳可检测到特征性的区带图。凝胶上的区带模式与已知有或无相关异常的样品比较后，获知是否存在同样异常。 RFLP分析常用于血色病基因（HFE）突变的鉴定（图2）。采用RFLP分析，很容易发现临床上两种重要的HFE突变——C282Y和H63D。这两种突变导致在HFE基因内形成限制性核酸内切酶切割位点，PCR产物经限制性核酸内切酶消化后，突变体DNA片段电泳模式与野生型有很大不同。 图2 用聚丙烯酰胺凝胶电泳行RFLP法分析HFE基因C282Y突变 无突变者（第4泳道），经RsaI消化后形成两个片段（185和146 bp）；HFE杂合基因型经RsaI消化后产生185、146、116和30 bp 4种片段（第2泳道）；HFEC282Y纯合子基因型在RsaI消化时产生116、185和30 bp（第3泳道） 5．荧光染料及熔解曲线分析 一些荧光分子能嵌入到双链DNA的小沟，在PCR反应时荧光染料结合进扩增子中使其可视化（图3）。这种方法成本较低，非特异性掺入任何合成的DNA，适用于多个目标为基础反应。不足是缺乏特异性。目前用带有熔解曲线（meltingcurve）分析的软件可解决引物二聚体问题。 6．等位基因特异性寡核苷酸杂交（斑点分析） 等位基因特异性寡聚核苷酸（ASO)探针斑点杂交，常用于β地中海盆血的基因突变检查。此法先分别合成野生型和突变型探针，用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交。杂交的结果有如下几种情况：①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交，示不存在这种突变；②只与突变探针杂交，示突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可杂交，示突变基因为杂合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交，示突变基因不属于已发现的类型。 7．杂交探针和水解探针 杂交探针和水解（Taqman）探针可能是现代分子血液学实验室PCR中最常用的特异性探针技术。水解或Taqman探针与杂交探针根本不同之处在于：只有在DNA聚合酶的5'-核酸酶活性存在下才产生荧光信号。通过专门探针设计，Taqman探针法还可用来鉴定SNP。野生型DNA由于在探针头部切断5'末端使荧光发射，但是在SNP存在下，阻止5'裂解的水解作用，导致缺乏荧光信号（图4） 8．变性高效液相色谱 变性高效液相色谱利用离子配对逆向层析的原理，利用离子配对试剂氨基与DNA的磷酸基（PO3-）形成离子配对，在流动相中带正电的氨基会将表面带负电DNA 包覆。若DNA长度越长，就带有越多磷酸基，因此有较多的TEAA结合，使其在管柱滞留时间越长。 未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同滞留时间的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。通过PCR反应大量扩增等步骤，当流动相中乙腈浓度梯度增大时，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形（图5）。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段，从而提供有无突变的信息。
四、PCR技术的实施策略 开展和实施使用提取DNA或RNA的分子血液学检测，取决于多种因素。随着仪器设计的不断改进，只需要简单分子生物学检测的专门培训即可应用，但临床需要和实验室资源之间的平衡仍然是考虑的重点。 第一，实验室需要将技术与应用信息与临床沟通，以确定真正的临床需求，因每一技术都有它的长处和不足。将临床对实验室各种检查的需求作一比较，使短缺的实验室资源尽可能地用于能影响临床决策的项目上。例如，实验室可以让临床了解精细和限制性很强的分子检测，适用性相对狭小。比如，要强调在伊马替尼治疗CML患者的MRD监测中使用扩增为基础检测技术的重要性，而此时FISH检测的意义不大。此外，标本类型，也很重要。建议CML患者MRD监测时使用外周血，而非骨髓。 第二，为确保测试准确的分析前处理与临床相沟通。基于RNA类检测标本的处理尤其需要特别小心，需要确保在送达实验室之前标本中的靶核酸未发生降解。周几或几时采血、运送问题、特殊采集容器问题等都需要高度重视。例如解释与报告凝血酶原G20210A和凝血因子VLeiden的检测结果，CYP2C9和VKORC1基因分型的结果，与止血血栓疾病诊断和治疗的结合，以及在最佳药物基因组学抗凝治疗时，这一层次的相互沟通极其重要。 第三，考虑实施提取核酸的PCR类方法，还是FISH或细胞遗传学方法，直接测序，或其他可用的方法时，需要从多个角度权衡。检测异常的灵敏度水平是决定的一个重要方面。标本中有大量异常细胞的疾病的初诊者，细胞遗传学和间期FISH的敏感性通常已经足够。对于检测≤10％的细胞群用间期FISH就比较难，即使采集到很大量的事件或细胞/信号数。目前，临床治疗的目标是使患者达到分子水平上的缓解，这就要求用PCR方法（灵敏度达10-5～10-6水平）检测MRD，FISH（灵敏度10-2或10-3水平）不适合MRD监测。 第四，PCR检测结果也应及时与临床沟通。最好在报告发出前，制定报告模板后，征求临床医生对报告的内容和格式的意见，以确保结果没有潜在的误解，更好地使格式容易纳入患者的治疗过程中。临床医生也必须知道，包含在报告中的有关试剂来源和方法学信息。 第五，仪器和具体方法的选择通常是需要考虑多种因素。例如，许多分子检测平台专门用于分子微生物学检测，因为病原体检测临床应用已久，有较多FDA批准的试剂和试剂盒。如果实验室已经有了分子微生物学检测设备，就容易添加分子血液学测试。 五、PCR技术的局限性 少量DNA污染可导致指数级扩增，故必须严格防止污染。通过使用良好的实验室操作，使用专用设备以及PCR前后区域分开，可降低风险。 常规的组织处理可能会阻止扩增。使用含强酸的溶液使骨组织脱钙显著诱导DNA降解并阻止扩增，甚至小的目标。福尔马林使DNA片段化，可以阻止大序列目标的扩增。一些组织化合物，如血红蛋白和尿素，对PCR起抑制作用。还有其他技术细节上的问题和临界值的评判等。 附2017年出版的WHO修订第四版有关MDS标准若干不同的最新解读 1．MDS-EB病态造血 在骨髓增生异常综合征各病种的诊断标准一表中，Blood 文章认为 1.血细胞减少的定义为Hb<100g/L，PLT <100×109/L，N<1.8×109/L；极少情况下， MDS可出现这些水平以上的轻度贫血或血小板减少。外周血单核细胞必须<1×109/L 2.如果存在SF3B1突变 3.外周血1％的原始细胞必须记录在至少两个不同的场合 4.RS≥15％的病例定义为有红系显明显态造血，并归类为MDS-RS-SLD 5.见表2 2．MDS重现性细胞遗传学异常 WHO蓝皮书的MDS诊断时重现性细胞遗传学异常及其频率这一表 表2 MDS诊断时重现性细胞遗传学异常及其频率（WHO，2017）
*若不符合形态学标准者，只有+8、del（20q）和-Y细胞遗传学异常，不被认为是MDS的确切证据；在原因不明持续性血细胞减少情况下，即使没有确切的形态学特征，除这3种以外的其他异常也被认为是MDS的推定证据 3．MDS-EB中存在伴有核红细胞明显增多和骨髓纤维化 在MDS-EB类型中，还可以分出伴有核红细胞增多和伴纤维化，分别称为MDS伴原始细胞和有核红细胞（明显）增多或MDS-EB伴有核红细胞（明显）增多、MDS伴原始细胞增多和骨髓纤维化（MDS-EB-F）。MDS伴原始细胞和有核红细胞（明显）增多常见预后不良的核型和TP53、RUNX1或ASXL1突变。MDS-EB-F为MDS-EB有明显的硬网蛋白（WHO标准的2~3级）。这些在2016年中均没有出现。 4.MDS等髓系肿瘤分类及其国际疾病形态学分类编码 详见下篇。
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