|
字幕全文  上一期提到了WGS，WES和Panel。WGS是对基因组每个碱基测序，而WES和Panel使用到了靶向测序技术。 靶向测序技术主要分为多重PCR和杂交捕获两条技术路线。所谓多重PCR，就是在一个体系中进行多个PCR反应。PCR的引物铺设在感兴趣的DNA区域，多轮反应后，目标区域就被显著富集了。 另一种方法叫做杂交捕获。将基因组DNA打碎为片段后，加入根据感兴趣区域设计的“探针”，把这些片段“抓”出来，从而达到富集的目的。 目前对于多重PCR和杂交捕获技术，已经有一些厂商可以提供定制服务。同时他们也提供较为通用的靶向测序方案，比如说WES的捕获试剂盒。在实际应用中，我们怎么知道选择多重PCR还是杂交捕获呢？这需要了解两种方法各自的特点。 由于多重PCR的实验步骤较少，在检测速度上要快于杂交捕获。它只需要对基因组进行扩增，对产物加上测序接头，就可以上机测序了。而杂交捕获则需要对基因组打断，加入探针使它们和目标片段杂交，使用磁珠将它们吸附出来并洗脱，再连接测序接头后上机测序。 在DNA用量上，多重PCR只需要不到10ng，而杂交捕获一般需要500ng以上（注：此处不讨论各技术的极限起始量，只针对一般情况）。 虽然多重PCR有着速度快，DNA起始量低的优点，但由于在富集过程中主要依靠PCR反应，因此它有交叉扩增和扩增效率不均一的问题。这需要投入较多精力优化扩增引物，保证测序的均一性。因此多重PCR比较适合较小的基因Panel，而杂交捕获的探针则相对容易优化，从而获得比较好的均一性。 也正是因为这样，多重PCR定制好的基因Panel较难补充基因进来，而使用杂交捕获的Panel在有新的基因被报道时，可以方便加入到现有的Panel中来。 在检测能力方面，对于多重PCR，引物区域的变异会影响扩增，需要其他位置的引物对来补救；而杂交捕获对于DNA模板的变异，有较高的容错性，这对检测变异更有利。 最后我们来总结一下。多重PCR方法检测速度快，可用于危急重症的检测；起始量要求低，可应用于微生物感染、法医学或肿瘤液体活检这一类样本珍贵的场景；多重PCR适合小规模目标的检测，例如少量基因或者热点突变的检测。 在时间不是很急、DNA的量足够多、筛查范围偏大的遗传学检测领域，杂交捕获是首选方法。它可以根据研究进展来扩展筛查目标，对多种变异类型有较好兼容性，同时可以获得比较好的捕获均一性。 关于靶向捕获测序技术就介绍到这里，我们下期再见！ 视频制作：大水 配音：凡树 文字：大水 |
|
|
