https://link./article/10.1007%2Fs00192-018-3817-x介绍间质性膀胱炎或膀胱疼痛综合征（IC / PBS）是一种慢性膀胱疾病，其症状包括下腹痛，尿急和尿频[ 1 ]。它可以在任何年龄的人中发展，但症状可能在年龄组内变化[ 2 ]。根据已发表的文献，IC / PBS的患病率为每10万名女性45例，每10万名男性8例[ 3 ]。根据膀胱镜检查，IC / PBS可[ 4 ]。当分析经典IC / PBS患者的活检时，组织学结果显示粘膜溃疡和广泛的炎症[ 5 ] .IC / PBS的病因仍未得到彻底理解，尽管研究人员之前已经提出了几种假设机制（肥大细胞激活炎症，吸收有毒物质，粘液层含有糖胺聚糖缺乏，上皮下膀胱层有慢性炎症反应等）。） 。 根据2010年美国泌尿学会（AUA）的国家泌尿外科研究议程，IC / PBS是需要通过基础研究和临床研究进一步研究的泌尿系统疾病之一，尤其是诊断和生物标志物[ 6 ]。但是，IC / PBS诊断没有金标准。国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）提出了一套诊断IC / PBS的纳入和排除标准，40％的IC / PBS患者可以根据这些标准进行诊断[ 7] ] 。基于目前的诊断标准，IC / PBS仍然代表一系列疾病，这使得难以开发用于IC / PBS和有效治疗的高灵敏度通用诊断工具.IC / PBS诊断没有精确的分子标记; 临床医生必须排除共同这些合并症疾病几种症状，然后开始对IC / PBS [治疗8，9 ]。最近的文献揭示了几种用于诊断的生物标志物，包括肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF），抗增殖因子（APF），血小板衍生的内皮细胞生长因子（PD-ECGF）和血管内皮生长因子（VEGF）。然而，这些生物 记物中没有一种对于诊断疾病是高度可靠的。 微阵列技术已应用于疾病相关遗传畸变的研究。该技术使我们能够通过直接检查膀胱活检的基因表达来更好地理解IC / PBS的分子特征。之前的一项微阵列分析数据研究调查了IC / PBS患者（NIDDK标准）和无症状对照之间的基因表达差异[ 10 ]。然而，迄今为止还没有研究整合这些微阵列数据集来鉴定关键基因并阐明IC / PBS和对照中的miRNA-mRNA调节网络。 生物信息学已成为许多生物学领域的重要组成部分，它结合了生物学，计算机科学，数学和统计学来分析和解释生物学数据。本研究使用微阵列分析筛选溃疡性IC / PBS膀胱活检组织和健康对照膀胱活检组织中差异表达的miRNA（DEM）和基因（DEG）。基因表达阵列获自GEO（Gene Expression Omnibus）数据库，该数据库存档并自由分发微阵列新一代测序和研究人员提交的其他形式的高通量功能基因组学数据。此外，对DEG进行功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析此外，还建立了监管网络，。还进行了miRNA的基因靶向的功能分析数据挖掘和整合的结果有助于揭示IC / PBS发病机制的分子基础以及IC / PBS诊断和治疗的潜在生物标志物和治疗靶点。 方法学习小组数据集[ 11 ]包括11个样品，5个IC / PBS样品和6个对照样品。对本研究可用的整个IC / PBS膀胱活组织检查的遗传分析可能会产生相互矛盾的结果; 因此，我们将研究中的指数分析局限于IC / PBS患者，这些患者具有典型的IC / PBS症状并且通过膀胱镜检查发现了Hunner溃疡。所有患者均为女性.IC / PBS 患者的平均年龄为78.0±7.5，而健康对照的平均年龄为59.2±13.2（p = 0.052）.IC / PBS患者的平均VAS（视觉模拟评分）为69.4±9.4，而健康对照的平均VAS评分为19±26（p = 0.016）.IC / PBS患者的症状平均持续时间为32.6±23.6个月，而健康对照的症状平均持续时间为7.7±10.8个月（p = 0.143）（补充表1）。本研究经中国四川大学华西医院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言。 微阵列数据溃疡IC / PBS样品的基因表达谱（GSE11783）从GEO（http://www.ncbi.nlm./geo）下载。GEO数据库是一个公众可以访问的功能基因组数据库，它用于存储微阵列和测序数据。所有在GEO数据库中具有Hunner溃疡的IC / PBS患者均根据NIDDK标准进行评估，而对照组未显示这些膀胱镜检查结果。收集来自膀胱组织的三至四个冷杯活组织检查（20mm 3大小），不包括三角区。 数据处理使用的GeneSpring GX V11.5软件进行标准化和随后的数据处理。确定了显示两组之间统计学显着性的DEG。进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）以验证通过微阵列分析鉴定的差异。然后通过使用的Benjamini-Hochberg的方法计算调整的p值（调整的p值）来校正微阵列的假阳性查询查询结果。截止标准调整为p值<0.001和| logFC | > 3.0。 基因本体论（GO）和途径分析FUNRICH是一种网络资源，提供对来自基因组研究的大量基因的功能性解释（http://www./）。在本研究中，FUNRICH用于进行基因本体论（GO）分析。本体包含三个层次：生物过程，细胞成分和分子功能。该p值表示在DEGS的GO和途径长期丰富的意义。截止标准是p <0.05。 通过比较微阵列产生的溃疡性IC / PBS膀胱活检组织和对照膀胱组织的转录组，使用Ingenuity途径分析（IPA）软件分析信号通路，上游调节剂，疾病和溃疡性IC / PBS特异性疾病。使用核心分析选项将GeneSpring检测到的DEG上传至IPA，以确定在溃疡性IC / PBS膀胱组织中调节哪些信号传导途径。 建立蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络和聚类选择在本研究中，DEGS的PPI网络是使用用于检索相互作用基因/蛋白质软件的搜索工具（STRING，http://string. /）构建的。STRING是已知和预测的PPI的生物学数据库，其可以提供系统范围的细胞过程视图。对数据进行积分和加权，并计算所有蛋白质 - 蛋白质相互作用的置信度分数。截止标准是置信度得分≥0.9。为了在PPI网络中找到基因簇，然后应用分子复合物检测（MCODE）。截止标准是“度数截止= 2”，“节点得分截止= 0.2”，“k-core = 2”和“最大深度= 100”。 的miRNA基因调节网络使用TargetScan（http://www. /）预测DEM的靶基因，其是通过寻找与每个miRNA的种子区域互补的特定序列来预测miRNA靶标的在线程序。根据使用站点的累积加权上下文++得分计算的预测目标效率对预测目标进行排序。在本研究中，前100个基因被选为每个miRNA的的靶基因。随后，使用Cytoscape的版本3.6.0可视化的miRNA-mRNA的调节网络，其描述了的miRNA与其在人膀胱平滑肌细胞对机械牵张的反应中的潜在靶标之间的相互作用。 结果鉴定DEG和DEM功能富集分析GO分析表明，与上调基因相对应的最显着富集的GO术语是“免疫反应”（本体：BP），“细胞外”（本体：CC）和“受体活性”（本体：MF），而最显着对应于下调基因的富集的GO术语是“细胞生长和/或维持”（本体：BP），“外来体”（本体：CC）和“钙离子结合”（本体：MF）（图 2）。 此外，IPA显示，与上调基因相对应的顶级规范途径是“粒细胞粘附和渗血”，“改变类风湿性关节炎中的Ť细胞和乙细胞信号传导”，“粒细胞粘附和渗透“，”原发性免疫缺陷信号传导“和”先天性和适应性免疫细胞之间的沟通，“与下调基因相对应的最显着富集途径是”LPS / IL-1介导的对RXR功能的抑制“，”异生素代谢信号传导“，”褪黑激素降解的超级途径“，”血清素降解“，”和“褪黑激素降解I”（补充表2）。上调基因的上游上游调节因子是脂多糖，IFNG，TNF，IL10和IL4，而CBX5，β-雌二醇，ESR2，ZEB1和WISP2是下调基因的最上游调节因子（补充表3）。与上调基因相关的主要疾病和病症是“炎症反应”，“免疫性疾病”，“结缔组织疾病”，“炎性疾病”和“有机体损伤和异常”，而与下调相关的最重要的疾病和病症基因是“癌症”，“有机体损 和异常”，'皮肤病和病症’，'胃肠道疾病’和'生殖系统疾病’（补充表4）。 建立PPI网络并确定中枢基因由STRING构建，由393个节点和1039个边缘组成，包括221个上调基因和172个下调基因（图 3））。此外，当应用相互作用得分并从最高到最低排序时，鉴定PPI网络中的顶部相互作用，例如TNFRSF1B，TNF，SYT1，SNAP25，SERPINE1和PLAUR基因。当“度≥20”被设定为截止标准时，PPI网络中的27个基因被鉴定为IC / PBS中的中枢基因，例如PNOC，SSTR1，FPR3，GPR18，APLNR，AGT，CCR6，CXCL6，LPAR3，FPR1。，C5AR1和GNG2。随后，使用MCODE从PPI网络中选择了27个群，并且显示最重要的簇由22个节点和231个边缘组成。此外，MCODE分析显示每个群含有一个“种子”基因，例如，CCL21，SERPINA1，TRIM6，PLOD2和P2RY10被鉴定为它们自身簇中的“种子”基因（图 4）。 构建的microRNA靶标调控网络。在我们的研究中，miR-21（这个MIR在targetsan上对应这3P和5P应该如何选择?）是最显着上调的miRNA，预计靶向一个上调基因（RASGRP1）和两个下调基因（KLF5和SC5D）.MiR-4435-2HG（这个MIR在targetsan上似乎搜索不多）是另一种上调的miRNA ，预计靶向AQP1和TNFRSF13C，这些是上调的基因.MiR -155HG被上调并预测靶向三种上调基因，即FGF7，TDO2和ZNF385D，以及四种下调基因，即AKR1C1，WEE1，WWC1，VAV3和CHST9.MiR -205HG是唯一下调的miRNA，预计靶向三种下调基因，包括SCNN1A，DST和FUT9，以及一种上调基因（CALCRL）（图 5）。 讨论目前，为了确认IC / PBS的诊断，临床医生必须根据症状进行鉴别诊断，然后进行膀胱活检以确认IC / PBS的组织学特征。然而，迄今为止还没有针对这种活组织检查的标准化活检程序。此外，在一些情况下，膀胱镜发现，尿标记物，或患者的症状不与所获得的数据的组织学结果很好地相关，并且不能以系统化的方式[进行比较12，13 ]。基于临床实践中的困难，临床医生需要一种快速有效的替代方法来检测IC / PBS，从而提前开始治疗。此外，IC / PBS的病理生理学和病因学仍不清楚。因此，重要的是探索IC / PBS和对照膀胱之间的分子差异，这可能有助于指导未来的诊断和病理生理学研究。 在本研究中，在溃疡性IC / PBS组和对照组之间鉴定出521个显着DEG，包括758个上调基因和763个下调基因，以及4个DEM。在DEGs中，鉴定了PPI网络中的前五个相互作用评分，即TNFRSF1B，TNF，SYT1和SNAP25。PPI网络中的27个基因被鉴定为IC / PBS中的中枢基因，即PNOC，SSTR1，FPR3和GPR18。随后，使用MCODE从PPI网络中选择27个簇，并且将CCL21，SERPINA1，TRIM6，PLOD2和P2RY10鉴定为“种子”基因。 PNOC编码前原蛋白，其调节多种蛋白质产物。这些产品包括伤害感受肽，nocistatin和孤啡肽FQ2（OFQ2）.Nociceptin 是一种17个氨基酸的肽，是孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）阿片类受体样-1（ORL1）的天然配体，也被称为NOP，OP4或LC132 [ 14 ] .nociceptin和ORL1受体（NOP）与强啡肽和κ阿片受体具有高度的序列相似性。之前的一项研究表明，N / OFQ参与疼痛感知[ 15 ]。关于PNOC的最新出版文献由Wachman等人进行，他们发现PNOC基因型与新生儿戒断综合征结果相关[ 16] ]。一些研究人员还注意到PNOC可能与受损的情绪和行为控制有关[ 17 ]。该证据表明，PNOC可能与IC / PBS患者的疼痛，情绪和其他一些综合征有关.SSTR1是1型生长抑素受体，具有两种活性形式（14和28个氨基酸）。它调节细胞增殖，可能是细胞生长和发育的调节因子。生长抑素的生物学效应受ģ蛋白受体家族的控制[ 18 ] 所述FPR3基因编码股与FPR 69％的同一性和83％的同一性与FPR2，这也被称为FPRL1 [351个氨基酸的肽19，20 ]。化学引诱物和与FPR结合的N-甲酰基甲硫氨酰 - 亮氨酰 - 苯丙氨酸在炎症部位诱导白细胞募集。这一证据表明，IC病理生理过程涉及免疫系统，这支持了以前的理论。 大多数在真核生物中发现了首次在秀丽隐杆线虫中发现的miRNA的[ 21 ]。据还预测的蛋白质编码基因的大约30％是由微RNA在人类[调节22，23 ]。为了更好地理解IC / PBS中基因表达与miRNA及其靶基因之间的相关性，我们构建了miRNA靶标调控网络。我们的研究表明，miR-21是最显着上调的miRNA，预计会靶向一个上调基因（RASGRP1）和两个下调基因（KLF5和SC5D）。的miRNA-21是多种细胞类型中丰富表达的miRNA的。该miRNA的的上调与多种癌症有关[ 24，25 ]。最近的功能性研究发现的的miRNA-21调节细胞生长，迁移和侵袭[ 26，27 ]。MIR-205HG是唯一下调的miRNA的，它是一种上皮特异性的miRNA，参与乳腺干细胞的上皮-质间转化状语从句：分化命运它参与肿瘤的发生，发展，多种肿瘤[预后28，29，30 ]。 我们的研究有一些局限性。首先，缺乏实验验证是一个合理的限制。从生物信息学分析中获得的预测结果可以通过未来的进一步实验研究来验证。其次，这项研究缩小了对IC / PBS基因标记的搜索范围，下一个研究步骤是对更多诊断为IC / PBS的女性进行类似的测试（在Hunner溃疡组中确定有用）。基于症状和glomerulations与空洞和再填充膀胱镜检查的瘀点出血。本研究是一项促进未来研究的试点研究，该试点研究的结果将一小部分IC / PBS和Hunner溃疡的女性与健康对照进行比较，这也有助于进行功效分析，以确定未来研究所需要的样本数量，并将这些基因检测应用于更大的IC / PBS妇女群体。第三，基因表达的小样本可能在生物信息学分析中诱导偏依。然而，这些发现是积极的，可以在测试更大的队列时识别的Hunner溃疡组中存在的基因标记。目前鉴定的标志物可能是 进一步研究的有用指南，以开发诊断工具和更广泛的IC / PBS女性更有效的治疗方法。基因表达的小样本可能在生物信息学分析中引起偏依。然而，这些发现是积极的，可以在测试更大的队列时识别Hunner溃疡组中存在的基因标记。目前鉴定的标志物可能是进一步研究的有用指南，以开发诊断工具和更广泛的IC / PBS女性更有效的治疗方法。基因表达的小样本可能在生物信息学分析中引起偏倚。然而，这些发现是积极的，可以在测试更大的队列时识别的Hunner溃疡组中存在的基因标记。目前鉴定的标志物可能是进一步研究的有用指南，以开发诊断工具和更广泛的IC / PBS女性更有效的治疗方法。 结论本研究将PNOC，SSTR1和FPR3鉴定为关键基因。上调的微小RNA如miR-21的，的miR-4435-2HG和的miR-155HG以及下调的的miR-205HG被鉴定为IC / PBS中的关键微小RNA。结果表明PNOC可能参与IC / PBS的疼痛综合征，而FPR3可能调节IC / PBS病理学中的炎症。该数据挖掘和整合的结果有助于揭示溃疡性IC / PBS发病机理的分子基础以及溃疡性IC / PBS诊断和治疗的潜在生物标志物和治疗靶标。 |
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