PNAS | 利用化学遗传学方法确定了一种生长素选择性激动剂

人们对于生长素的认识已有超过百年的历史，生长素可以在植物快速分裂的组织如嫩芽、茎端和根中合成，可以主动或者被动运输到植物的各个部分，生长素在组织间的运输以及特定部位的聚集影响了植物生长发育的各个过程，包括胚胎形成、叶发育、维管组织分化和根发育等。生长素可以通过输入或者输出载体在植物组织间有方向的流动【1】。经典的生长素信号转导主要是通过３类蛋白完成，包括生长素受体TRANSPORT INHIBITOR RESISTANT 1/AUXIN SIGNALING F-BOX (TIR1/AFB) (TIR1/AFB)、转录抑制子AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (AUX/IAA)（Aux/IAA）以及生长素响应因子AUXIN RESPONSE FACTOR （ARFs）。一定浓度的生长素存在时，生长素共受体蛋白TIR1/AFB1-5形成SKP1-CULLIN-F-BOX（SCF）复合体并通过与 Aux/IAA 的相互作用泛素化降解转录抑制子 Aux/IAA，从而释放出有活性的 ARFs 并启动下游生长素相关响应基因的表达【2】。

近年来，化学遗传（Chemical genetics）作为一种新型的研究方法正逐渐得到推广和应用。该方法利用活性小分子化学物对研究材料进行筛选与鉴定，从而解析蛋白的功能。近日，来自瑞典农业大学的Stephanie Robert课题组在PNAS上在线发表了题目为Selective auxin agonists induce specific AUX/IAA protein degradation to modulate plant development 的研究论文。该研究从8000个化合物中筛选到一种小分子化合物，其可作为生长素选择性激动剂特异性的诱导Aux/IAA 蛋白降解从而调控植物发育。

植物体内的泛素蛋白酶体途径在植物信号中有重要作用。类泛素化蛋白 RELATED TO UBIQUITIN/NEURAL PRECURSOR CELL EXPRESSED DEVELOPMENTALLY DOWN-REGULATED PROTEIN 8 (RUB/NEDD8) 可修饰该途径中的一些组分，对维持蛋白酶体的活性非常重要【3】。在植物体内，激活NEDD8 需要AUXIN RESISTANT 1 （AXR1） 的参与，其缺后会影响激素响应。在该研究中，研究人员利用化学生物学筛选，通过对比 Col-0 和 axr1-30 幼苗表型，结合生长素所影响的主根长度、下胚轴长度和侧根数目作为主要的指标，从8000个化合物中识别了34个作为潜在的目的小分子，发现四个小分子 RubNeddin 1—4 （RN 1—4）是作用明显。通过处理 Col-0 幼苗发现 RN1 减少侧根数目和主根长度，增加下胚轴长度；RN2 抑制主根生长和侧根形成，对下胚轴无影响；RN3 促进侧根数目的增加；RN4 增加下胚轴的伸长和侧根的形成。这些结构相似的化合物对 axr1-30 处理，发现并没有明显的变化，表明这些化合物确实是 RUB/NEDD8 发挥功能所必须的。通过与 2,4-D，2,4,5-T 的功能进行比较，该研究进一步确定，RN1，RN3 和 RN4 促进植物的生长发育，这表明RN1，RN3 和 RN4 可以作为生长素潜在的激动剂。

图 四种RN引起不同的形态学变化

为解析 RN3 和 RN4 在生长素信号途径中的作用，研究人员通过转录组测定 IAA，RN3 和 RN4 对拟南芥幼苗的影响。结果表明，IAA，RN3 和 RN4 都显著上调了生长素的早期应答基因 IAA1，IAA2，IAA3 和 IAA30 的表达，IAA 和 RN3 诱导 IAA5 和 IAA16 的表达，而 IAA 和 RN4 诱导 IAA10 和 IAA29 的表达。IAA，RN3 和 RN4 之间有许多表达不一致的基因，例如 LBD16, PBP1 和 PIN3 等，确认了 RN 参与生长素相关的发育进程。而通过免疫组化试验发现在体内生长素信号对于 RN3 和 RN4 的初始响应有所差异。

图 RN3和RN4激活独立的生长素应答

通过转录组学数据发现，RN3 和 RN4 影响 AUX/IAA 的降解，而具体的蛋白机理是未知的，因此通过对生长素调控侧根的功能获得型突变体中分析 RN3 和 RN4 的敏感性，用 RN3 和 RN4 分别处理 axr5-1，axr2-1，slr-1和 shy2-2 幼苗，发现 RN3 对于slr-1不敏感，而对shy2-2超敏感，表明 RN3 对于 SLR 在调控侧根的发育过程中没有功能。同时发现 RN4 在不同的浓度下对这几个突变体的敏感性不同，主要对于axr5-1 和 shy2-2 起作用。另外，研究人员也研究了 RN3 和 RN4 对顶端弯钩形成的影响，发现 RN4 对于 AUX/IAA 的影响在侧根和顶端弯钩有不同的模式。

为更好的研究 RN4 在顶端弯钩发育中的作用，研究人员通过在 0.5 微摩条件下的拟南芥幼苗的顶勾表型进行 EMS 筛选，发现并命名为 hkb 突变体，而通过突变体验证，发现 hkb 确实对 RN4 不敏感，而对 hkb 全基因组序列分析后发现，hkb 突变体主要是由 BRM 序列（C-T替换）导致，通过 T-DNA 插入突变体比较两个的表型比较接近，而且都对 RN4 不敏感，因此，确定了 BRM 基因在 RN4 对顶端弯钩的形成不可或缺。

图4 hkb 突变体对 RN4 在顶端弯钩发育是不敏感的

综上可知，研究人员通过一系列的化学生物学、免疫组化等试验方法，识别了生长素的新类似物，并通过 SAR 和 EMS 诱变，确认了 RN3 和 RN4 为新的生长素的类似物，并解析了其通过影响 AUX/IAAs 的结合，从而影响生长素下游响应，并调控顶端弯钩形成的分子机理。研究结果有助于加深对生长素的认识，丰富了生长素信号传导的内容。

参考文献

[1]. Teichmann T, Muhr M (2015) Shaping plant architecture. Front Plant Sci 6:233.

[2]. Wolters H, Jürgens G (2009) Survival of the flexible: Hormonal growth control and adaptation in plant development.Nat Rev Genet10:305–317.

[3]. Calderon-Villalobos LI, Tan X, Zheng N, Estelle M (2010) Auxin perception—Structural insights. Cold Spring Harb Perspect Biol 2:a005546

论文原文链接：

https://www./content/early/2019/03/07/1809037116