慢病毒是逆转录病毒科下面的一个属,之所以成为慢病毒,是因为这些病毒具有长达数年的潜伏期,其中人HIV,猴SIV,猫FIV都是慢病毒。 逆转录病毒至少包含三种基因: gag包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen) pol包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase) env包含组成病毒外壳的基因(envelope)。 逆转录病毒可以分为三类:致瘤病毒(导致癌症);慢病毒(导致慢性病);泡沫病毒(不导致疾病)。 Gag形成病毒核心,pol编码各种RNA相关酶,env编码外壳蛋白。
Env:编码Env蛋白。该蛋白包括包膜糖蛋白前体gp160、包膜糖蛋白gp120和gp41。gp160在蛋白酶作用下分解为gp120和gp41两种包膜糖蛋白。gpl20暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白,感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白结合;gp41称跨膜蛋白,镶嵌于病毒包膜脂质中。 RT:逆转录酶 RNase H:RNA酶 IN:整合酶 PR:蛋白酶 Tat:调节病毒RNA基因组的反转录,确保有效的合成mRNA,并调节细胞释放病毒颗粒,是HIV-1复制所必需的转录激活因子。Tat蛋白是一种反式激活因子,与LTR上的应答元件结合后能启动及促进病毒基因的mRNA 转录。 Rev:调节病毒蛋白的表达,Rev是HIV-1复制所必需的,缺少Rev功能的前病毒具有转录活性,但不能表达晚期基因,不能产生病毒粒子。 LTR:长末端重复序列(LTR),反转录病毒的基因组的两端各有一个长末端重复序列(5' LTR和3' LTR),不编码蛋白质,但含有启动子,增强子等调控元件。病毒利用LTR将基因组整合到宿主基因组中。 顺式作用元件(cis-acting element),位于基因的旁侧,可以调控影响基因表达的核酸序列。包括启动子(promoter) 、增强子(enhancer)、应答元件(responsive elements)等。其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因。其本身并不编码蛋白质,可以与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 反式作用因子(英语:Trans-acting factor),是参与调控基因转录效率的蛋白质因子,可以直接或间接识别或者结合顺式作用元件核心序列,可对基因表达产生激活或阻遏的作用。 反转录转座子(retrotransposon),简称“反座子”(retroposon),是由RNA介导转座的转座子的元件,在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似,只是没有病毒感染必须的env基因,它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座,每转座1次拷贝数就会增加1份,可以增强自己的基因组。因此,它是许多真核生物中数量最大的一类可活动遗传成分。在植物中特别丰富,它们是核DNA的一个主要组成部分。 反转录转座子可以分成两大类: 一类是LTR反转录转座子,是具有长末端重复序列(long terminal repeats,LTR)的转座子,这也是反转录病毒基因组的特征性结构,这类反转录转座子可以编码反转录酶(Reverse transcripatase)或整合酶(integrases)。 另一类是非LTR反转录转座子。 RCR:replication-competent recombinant,产生有复制能力的反转录病毒。 第一代HIV-1来源的慢病毒载体: 第一代慢病毒载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 第二代HIV-1来源的慢病毒载体。在第一代的包装质粒上剔除一些反式作用因子,所以还是三质粒组成。 载体质粒:插入我们的目的片段。插入的目的片段两侧有LTR,有助于整合到宿主基因组上。 第三代HIV-1来源的慢病毒载体,在第二代的包装质粒基础上,将gag和pol分散到两个质粒上,这样第三代系统由4个质粒组成。
病毒制备: 将三个/四个质粒一起感染细胞,培养一段时间后收集上清中的病毒。 |
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